如我们前一篇文章提到，吖啶酯的核心结构如图1所示，R和X可以是多种合适的基团，目前中国市场上主流的吖啶酯衍生物如图2所示: NSP-DMAE-NHS (CAS NO. 194357-64-7)和NSP-SA-NHS (CAS NO. 199293-83-9)。

吖啶酯的光激发反应分为两个步骤，如图3所示。首先，过氧化氢阴离子在酸性条件下，加成到吖啶盐的9号位上。随后，离开基团X通过四面体二氧环丁烷中间体进行分子内电荷转移，迅速分解，并产生吖啶酮和化学光。一般来说，对于这种涉及四面体中间体的化学反应，离去基团可以通过改变反应中心的电子密度或空间环境，对反应动力学产生影响。吖啶盐与过氧化氢的反应也是如此。例如，10-甲基吖啶-9-羧酸盐中离去基团的pKa对化学发光反应的产光效率有着显著的影响。该类化学发光中反应中，吖啶盐的发光输出速率受到磺酰胺离开基团的电子性质的影响。磺酰胺离开基团上的给电子基团降低了光的生成速率，而吸电子基团则会缩短化学发光的反应时间。

同样，磺酰胺离去基团上的空间取代基团的加入也会降低产光速率。因此，想要提高吖啶的产光效率，可以通过修饰吖啶酯分子，比如在磺酰胺离去基团上引入特定的吸电子基团。能够在特定的时间内产生更多的光量，意味着化学发光分析仪可以捕捉到更多的发光信号，从而提高检测试剂的灵敏度。

通过对于上述化学发光反应机理的理解，提高吖啶酯平台试剂的灵敏度有以下方法：1.通过修饰吖啶酯本身化学结构，提高产光效率；2. 提高吖啶酯的亲水性能，使检测试剂有更低的背景，从而提高信噪比（信号与背景的比值）；3. 加入表面活性剂，增加吖啶酯的产光效率。

目前已经有化学发光厂家引入了新型的“高光子产率吖啶酯”，如图4所示，以及“低非特异性吸附降的吖啶酯”，如图5所示，他们都有着各自的应用场景。前者可以提高单位时间内的光子产出从而提高灵敏度，后者可以降低检测试剂的背景值以提高灵敏度。

吖啶酯激发液中可以适当加入一些表面活性剂。一些研究中提到，在反应体系中加入一些非离子或阳离子表面活性剂可以显著提高吖啶酯的产光效率（图6）。

化学发光检测系统中，磁珠也是非常重要的一环，为检测系统选择合适的磁珠对提高试剂的灵敏度至关重要。

 磁珠粒径

目前化学发光检测试剂常用的磁珠粒径一般在1μm至3μm左右，可以根据自己的化学发光平台去筛选合适粒径的磁珠。虽然理论上磁珠的粒径越小，它的比表面积就越大，能承载的抗体也就越多，从而提高灵敏度。但是在选择粒径上不能脱离化学发光平台自身的情况，各个厂家的化学发光仪器都是封闭系统，仪器的磁分离系统、清洗工作站各不相同，如果为了提高灵敏度盲目选择小粒径的磁珠可能无法适配仪器，反而起到反效果。

含铁量

磁含量指的是磁珠中铁的比重，含铁量的多少直接影响磁分离速度。目前市面上主流的磁珠含铁量为20%~50%左右，同样需要根据化学发光仪器的磁分离系统、清洗工作站进行合适的选择。过高的含铁量固然可以提高磁分离速度，但是目前在仪器成型的条件下，过高的含铁量会造成不同程度的磁珠聚集，以及清洗后分散不均一，造成精密度变差和特异性不好等情况。

磁珠官能团的选择

目前磁珠最常用的偶联官能团是羧基（-COOH）和甲苯磺酰基（-Tosyl）。在抗体已确定的情况下，可以尝试不同的磁珠官能团，通过目前已经发展成熟的工艺，将抗体至磁珠上。这两种官能团，在生物偶联这门边缘学科上，称之为零长度交联剂（zero-length corsslinkers）。顾名思义，它是生物偶联中最小的试剂，这些化合物通过形成稳定的没有额外原子的化学键以连接生物蛋白。

从偶联的蛋白种类来看，通常情况下，抗体和抗原的偶联均可使用羧基官能团，而一些抗原不适合偶联甲苯磺酰基。从非特异性角度考虑，由于疏水性，甲苯磺酰基磁珠本身具有一定的被动吸附，如封闭过程处理不当，也有可能造成一定的非特异性。从工艺放大角度考虑，羧基磁珠常使用一步法碳二亚胺（EDC）在pH6.0左右进行偶联，部分特殊的抗原偶联，两步法EDC效果更佳。羧基磁珠的偶联需要考虑最佳的EDC浓度、蛋白偶联的比例，但在化学发光平台建立后这点往往被研发人员忽视。而甲苯磺酰基的反应往往在pH9.6左右进行偶联。对于羧基磁珠而言，选择合适的羧基含量也是非常重要的，并非羧基含量越高，所体现的试剂性能最好。

此外，部分国际供应商还提供氨基（-NH2）和羟基（-OH）的官能集团，用于一些特殊项目的开发，如部分传染病抗体检测项目。

目前国际大厂部分项目使用羧基或甲苯磺酰基磁珠，通过高分子化合物的预活化，形成更稳定，链长更长的预活化磁珠，用于开发检测项目。对于部分项目而已，具有抗体使用量少，空间位阻效应小，灵敏度高等优点。

链霉亲和素-生物素系统及生物素衍生物的选择

上述方法虽然方便且稳定，但对提高试剂的灵敏度很有限，此时可以考虑引入链霉亲和素-生物素系统来进行抗体的固相化。在此方法中，抗体首先需要进行生物素化处理，利用商业化生物素上的N-羟基磺基琥珀酰亚胺 (NHS) 酯，与抗体上的伯胺基团（-NH2）形成稳定的酰胺键。

在商业化生物素中，相比传统生物素。一些生物素衍生物（图7所示）可以很好的提高蛋白在水中的溶解性，并且延长空间臂长，改善空间位阻效应，从而提高检测试剂的灵敏度，可以通过实验自行选择不同臂长的生物素。

除了利用长臂长的生物素以外，也可以利用抗SA（链霉亲和素）抗体改善空间位阻效应。抗SA抗体包被在羧基或甲苯磺酰基磁珠上，再引入链霉亲和素使其固相化，于是磁珠就能与生物素化的抗体结合，从而很大程度上延长空间臂长，从而改善空间位阻效应。相比传统的SA直接偶联磁珠工艺，使用SA抗体的链霉亲和素磁珠制备工艺，具有重复性更强，更易于放大，特异性更好等优点。单克隆抗体偶联磁珠，无论是偶联还是封闭工艺，均比抗原偶联更为成熟，也是各厂家极为熟悉的方法。

链霉亲和素单克隆抗体能灵敏特异地结合链霉亲和素，可用于制备链霉亲和素磁珠。

在吖啶酯和磁珠偶联工艺都已经确定的情况下，还想进一步提高试剂本身的灵敏度，降低非特异性吸附，此时需要进行反应体系的优化。优化反应体系的pH值、缓冲体系和盐离子浓度，优化磁珠和吖啶酯标记物的反应浓度和体积，寻找合适的表面活性剂，均可以一定程度提高检测试剂的灵敏度，减少非特异性吸附。此外，在试剂反应体系中选择合适的保护蛋白，增加合适的无机离子，添加合适的多元醇或者表面活性剂，对于试剂的稳定性也有极大的改善。关于反应体系，这里无法详细展开说明，每个厂家需要根据自己的实际情况进行调整。

化学发光检测系统中，抗体是最重要的组份之一，大多数研发人员会把研发重点放在这里。目前，化学发光主流的抗体为小鼠单克隆抗体。然而随着部分项目对于检测灵敏度的需求，使得小鼠单克隆抗体的性能达到了瓶颈。因此，针对一些灵敏度需要高的项目，可以尝试选用如兔单抗、山羊单抗、猪抗以及各种重组抗体等不同种属的产品以实现试剂灵敏度的进一步提升。目前，HyTest通过不断的技术迭代升级，建立了新一代重组及嵌合抗体平台。基于该平台，所开发的新型肌钙蛋白以及神经纤维丝轻链等均展示出了鼠单抗所不能比拟的反应性能。

然而需要注意的是，选择高灵敏度且特异性强的抗体固然重要，但是需要筛选与之匹配的标记、包被工艺和反应体系。