一旦检测方法被证明可行，就会进入验证阶段。
在这个阶段，一些个别性能特征会被验证，以满足各自的设计输入要求，同时整体性能会被验证，以满足预期的使用和用户的需求。
本文详细介绍了如何使用现有的CLSI文件来满足验证的要求。
验证需要以全面的风险评估为基础，包括对检测方法如何被终端用户实验室使用，以及可能被滥用的认识。
这些研究通常遵循一个反复的过程，对最终设计的检测方法进行关键性的评估，该检测方法将被最终用户用来确定是否满足临床和分析性能要求，因此这种研究通常是针对最终设计产品的多个生产批次（或其等同物）进行的。
整体验证建立在单个验证研究的基础上，以确定最终设计检测方法的性能是否满足预期的临床用途和用户需求。
为了验证定量检测方法的分析性能，至少可以根据CLSI文件进行以下研究：精密度、偏倚（正确度）、测量间隔、校准间隔、检测能力、分析特异性、灵敏度和特异性以及试剂和样品稳定性。
分析和临床性能的验证（见第9部分）可能需要调查其他问题，这取决于检测方法和测量物的性质。如EP. 3所述，在将参数与设计规范进行比较之前，需要确保参数被准确估计，这将决定测试的范围。
如果使用软件来处理数据，必须了解软件是否有足够的功能来完成为检测方法设计的任务。
不同的样品类型以及不同的抗凝剂和防腐剂可能对检测方法的性能产生不同的影响。因此，重要的是评估不同样品类型、不同收集介质或使用不同抗凝剂或防腐剂的性能，以适合该设备的预期用途。
无论使用何种样本类型，在评估开始前，研发工程师必须评估相关储存条件下的样本的稳定性，例如，如果在检测方法性能验证中使用冷冻标本，则包括冻融循环的影响。
1、精密度
根据CLSI文件EP05和EP12，精密度研究需要在检测方法所针对的样品或基质中进行。
由于精密度在整个分析范围内可能会有变化，因此为精密度研究选择的浓度需要跨越设备测量范围的很大一部分，其中更多的浓度要尽可能接近「医学决定水平」。
如果生产厂家需要获得对检测方法的再现性的估计，可以在不同的仪器（如果适用）、在不同的地点、用不同的操作人员来进行检测方法。
对于浓度接近测量区间下限的精密度，CLSI文件EP17提供了关于研究设计和分析的有用信息。
对于有两种结果（如：阳性、阴性）的定性测试，CLSI文件EP12对接近分界线的样品的精密度进行了描述。此外，CLSI文件EP15是为那些希望用最小的方案（验证）来验证生产厂家的性能声明的有效性的用户准备的。
2、偏倚（正确度）
偏倚（正确度）在计量学意义上被正式定义为测试结果的期望值与使用参考方法获得的公认参考值之间的差异。
当参考值是用一种不符合参考方法口径的方法获得的时候，大多数情况下，这种差异被简单地称为差异。为简单起见，本文使用术语「偏差」来指称这两种情况。
CLSI文件EP09论述了评估偏倚要求的一种常用技术。该文件建议使用至少100个跨越测量区间的病人样本，在不同的日子里进行，使用不同的校准和试剂批次。
CLSI文件EP09还涉及最终用户对定量性能要求的验证。在这种情况下，该文件建议对跨越测量区间的40个病人样本进行比较。
3、测量区间
对于定量检测方法，需要建立一个定量测量的线性区间。对于非定量检测方法，如带有定量或序数（也称为「半定量」）测量的定性方法，可能没有必要进行线性评估。
CLSI文件EP06为线性范围的评估提供了指导。基本的研究设计要求进行多次测量，其浓度不同，通过稀释比例或配方知道彼此之间的相对关系。如果允许不同的样品类型进行测试，可能需要对每种样品类型进行线性评价。
实验室主任根据对可接受的线性范围、精密度和定量限（LoQ）的期望来决定测量间隔。测量区间的最终决定还需要确定线性的性能特征（见CLSI文件EP06），以及精密度标准（见CLSI文件EP05）和检测能力（见CLSI文件EP17）。
4、参考区间
对于定量检测方法，参考区间需要由生产厂家或实验室确定，并由进行测试的实验室确认。
建议至少测试120个合格（健康）参考个体的样本，以便在95%参考区间的界限附近确定90%的CI。使用更大的参考个体样本可以提高参考区间估计的精密度。
建议用于确定参考区间的参考个体（针对该被测量）应来自预期使用人群，可能需要包括不同年龄组和男女，并来自有代表性的地理位置。CLSI文件EP28为生产厂家和实验室提供了确定定量检测的参考值和参考区间的指南。
5、灵敏度
根据CLSI文件EP17，灵敏度，有时称为「分析灵敏度」，可以用空白限（LoB）、检测限（LoD）和/或LoQ来描述。根据CLSI文件EP17，在确定检测方法的分析性能特征时，需要考虑不同的变异源，如不同的日子（至少三到五天）和不同的重复（每次运行至少两个重复）。
在设计研究时，建议生产厂家考虑用两个或更多批次的试剂进行LoD研究，以试图捕捉不同仪器/试剂系统的预期变异性。样品和测量的数量与估计LoB的不确定性和样品测量之间的变异性（SD）有关。
LoQ是指能够以符合实验室要求的准确性（偏差和精密度）可靠地检测到的被分析物的最低浓度。CLSI文件EP17指出，最小的设计是两批试剂，一台仪器，三天，每个样品有三个重复，四个已知浓度的独立低水平样品，每个试剂批共有36个低水平样品（在所有样品、仪器和天数中）。
样品和测量的数量与估计的空白界限不确定性和样品测量之间的变异性（SD）有关。
6、特异性
分析特异性是对检测方法在存在干扰现象/影响量的情况下正确识别或量化被测物的能力的衡量，具体如下：
在定量测试中，结果是一个浓度，检测方法只确定它要测量的成分的能力，或检测方法只对特定分析物的所有子集做出反应而不对样品中存在的其他物质做出反应的程度。
对于定性（或序数）测试，例如，存在或不存在某种细胞类型，检测方法在存在干扰现象（如高背景白细胞数）的情况下测试病人样本时获得正确结果的能力。
因此，根据检测方法，对可接受的分析特异性的验证可以包括干扰研究和交叉反应研究。
然而，基质也可能影响检测方法的性能。
基质效应是指样品本身的属性对分析物的测量值的影响，如粘度、表面张力、浊度或离子强度。
验证需要包括确定用于校准、质控测试和/或PT的预期材料中是否存在基质效应。关于研究设计和数据解释，请参考CLSI文件EP14。
携带/携带污染研究在技术上不属于分析特异性研究，但对于可能容易出现样品或试剂结转的测量系统，可能需要进行这种研究。
6.1、干扰
在验证过程中，有必要使用在预定环境下测试病人时可能遇到的潜在干扰物的浓度进行综合干扰研究。CLSI文件EP07重点关注特定物质或条件（例如，干扰物质的存在或粘度的变化）如何改变患者样本的结果。
CLSI文件C56为生产厂家提供了建立溶血、黄疸和脂血/浊度指数的建议，以及由终端用户验证这些指数的建议。
一般来说，每一种潜在的干扰物质首先要用高浓度的该物质进行测试，测试的浓度为该分析物的医疗决定浓度。
如果最初的测试表明有干扰，则需要进行额外的测试，以确定检测方法所能容忍的最高浓度的干扰物质的水平，并确定干扰的特征。
如果没有观察到明显的临床影响，则不需要进行额外的测试。详细测试程序请参考CLSI文件EP07。
6.2、交叉反应
交叉反应是指与目标测量物（如抗原、抗体、代谢物或核酸）结构相似的同系物可能与免疫化学或酶法中的反应性成分发生交叉反应。
对于分子检测方法，与被测物密切相关的类似核酸序列和/或生物体的交叉反应将导致分析特异性差。
目前还没有CLSI文件涉及交叉反应性的评估。每个实验室都需要根据当地监管机构的要求来验证自己的检测方法。
6.3、携带污染
在某些检测方法中可能会出现携带污染。它可以以不同的方式表现出来，其中之一就是携带污染。
在以核酸为基础的检测方法中，以前的阳性反应的扩增子很容易扩散，在测试前会污染其他样品，导致假阳性结果。
携带污染通常出现在高通量实验室中，污染发生在高阳性孔到附近的低阳性或阴性孔。
目前，没有CLSI文件来解决携带污染的问题。一般来说，为了评估携带污染，建议对高阳性样品进行串联测试，与阴性样品交替进行，其模式取决于测量系统的操作功能。一般的临床实验室医学教科书可以提供更有用的指导。
7、总分析误差
CLSI文件EP21中描述的分析方法为生产厂家和最终用户提供了一个工具，以测量总分析误差（或总分析差异），如果比较方法不是主要参考检测方法，或可追溯到一个定量检测方法。
总分析误差/差异是基于对患者样本的方法实验的比较，它可以相对于预先设定的临床可接受性目标进行评估。
8、稳定性
在开发步骤中，生产厂家可以进行初步的稳定性测试，以确保产品满足所有的设计输入要求，并在规定的试剂储存和处理条件下，仍然适合其预期用途。
详细的研究设计和数据分析请参考CLSI文件EP25。
试剂的稳定性通常同时衡量实时稳定性和使用稳定性。
如果产品要运给客户，则有必要进行压力测试研究，以模拟产品在运输过程中可能遇到的「最坏情况」的运输条件，然后再由客户对其进行正常的储存条件处理。
由于稳定性测试是实时进行的，最终的稳定性要求通常是在验证步骤中确定的。用商业试剂生产LDT的实验室可以依靠生产厂家对这些试剂的声明，如果试剂和储存条件没有被修改的话。
在特定的时间段内对稳定的被测物制剂（即质控材料）进行重复测量是定量检测方法试剂或具有定量或序数测量能力的定性检测方法试剂稳定性评估的一个指标，试剂在预定的时间点使用适当的样品进行测试。
此外，样品在受控和假定的稳定条件下储存的试剂上进行测量。
测量物漂移是以绝对浓度计算的，或者是与储存在假定稳定条件下的试剂相比的相对或百分比浓度，或者是通过对研究中所有时间点上观察到的测量含量（Y轴）与时间（X轴）的回归分析来计算。
用于评估测量物漂移的样品可包括相关的校准物和至少三个额外的低水平、任何医疗决策水平和高水平的样品。
实时稳定性：试剂的保质期通常通过实时稳定性测试来评估，试剂要在规定的储存温度下储存。CLSI文件EP25建议，实时稳定性研究的测试时间表需要延伸到所需的持续时间要求之外，以确保稳定性要求的持续时间完全被检测方法数据所包含，而不需要外推法。
使用稳定性：使用稳定性研究用于确定IVD试剂在投入使用后保持其性能特征的时间。建议对与机载仪器测量系统一起使用的试剂，或对重组的试剂，以及对手动或半自动系统的部分使用的试剂盒进行这些研究。
压力测试：根据CLSI文件EP25，压力测试是通过让产品经历预先确定的温度、湿度、光照和/或其他环境因素的变化序列，然后将其置于正常的储存条件下，开始进行保质期和使用中稳定性测试。运输模拟研究的结果与正常储存条件下的基线结果进行比较，以确定是否有任何产品的稳定性声明受到压力条件的影响。
9、临床性能
可能需要对目标人群的代表进行临床研究，以确定检测方法的临床正确度。衡量临床正确度的标准是灵敏度、特异性、预测值、符合率和似然比。
建议对于定量检测方法、带有数字信号的定性检测方法或基于序数测量的半定量检测方法，在进行临床验证之前，应在开发步骤中确定一个或多个区分阳性和阴性结果的临界值（或半定量检测方法的不同类别）。
根据CLSI文件EP24的建议，利用初步数据选择适当的截断值，可以通过基于ROC分析的相关敏感度和特异性水平来证明，临床研究提供了对具有最终截断值的检测方法性能的估计。
注：如果该检测方法打算在多个实验室使用，那么临床研究需要在多个实验室使用不同的操作人员和仪器进行。如果试剂可以在不同的仪器型号上使用，可能具有不同的性能规格，那么就需要在每个型号上测试试剂。
在候选检测方法上测试有和没有目标条件的标本。试样中是否存在目标条件，可以通过一个基准方法（金标准）或一个比较方法来确定。
在第一种情况下，金标准可以比候选检测方法更直接地测量该条件的分析物/标记物，从而更可靠地确定目标条件的存在或不存在。
例如，丙型肝炎病毒（HCV）RNA的检测可以构成抗HCV的检测方法的金标准。
候选检测方法和金标准的结果可以在2×2的或然率表中进行比较。对于这种情况，临床表现的相关措施包括灵敏度、特异性以及阴性和阳性预测值。
在第二种情况下，比较方法可能是另一种被批准的与候选检测方法相同的测量项目的方法。在许多情况下，对比方法可能已经根据金标准进行了评估。在这种情况下，性能的衡量标准被表示为阳性和阴性符合率。
候选检测方法需要与一个基准进行比较，以确定是否存在目标条件。
需要考虑评估临床表现的两种主要情况：
当对目标状况有最好的评估时（即已知的临床诊断，以前称为「金标准」，现在称为「诊断准确性标准」）；
或者使用已知的临床诊断以外的参比方法。
临床研究样本应该用候选检测方法和诊断准确性标准进行测试。
对于具有二元输出（阳性、阴性）的定性检测方法，检测方法的性能由灵敏度和特异性（如果临床诊断是已知的），或阳性和阴性符合率（如果使用诊断准确性标准以外的参比方法）描述。
有两种结果的定性测试的结果和比较者方法的结果，临床研究中标本的结果可以用2×2的或然率表来比较。
根据评价结果，可以计算出灵敏度和特异性、疾病流行率、阳性检测结果的预测值、阴性检测结果的预测值、阳性检测结果的可能性比和阴性检测结果的可能性的估计值。
更多细节请参考CLSI文件EP12，包括待测标本的数量、标本采集信息以及定性检测性能的数据分析。
在区分分析准确性和诊断准确性标准时，有时会出现混淆，因为它们可能是也可能不是相同的背景。
例如，在评估A型流感检测时，分析参考方法和诊断准确性标准是相同的，因为A型流感的存在总是被认为是异常的。
相反，对于人乳头瘤病毒检测，分析参考方法（是否存在被测物）和诊断准确性标准（妇女是否有宫颈疾病）是不同的。
临床表现可能取决于许多问题，而不是诊断的准确性，或除此之外。例如，检测方法可用于评估各种治疗方法，如药物治疗；因此，临床表现最终可能取决于分析精密度和其他因素。
CLSI没有关于许多此类用途的相关文件，但研发工程师和使用者可以参考临床实验室医学的文本。
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来源：诊断科学
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