核酸扩增方法已被用于提高传统免疫测定的灵敏度，改善信号的产生，从而提高测定的灵敏度。包括聚合酶链式反应（PCR）和包括「实时」PCR（rt-PCR）和免疫PCR（iPCR）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、自持序列复制（3SR）和链式置换扩增（SDA）等在内的几种技术，正在实验室环境中广泛使用。下面将讨论一些核酸扩增方法，它们特别适合用于免疫测定应用。

2.1、免疫-PCR

免疫PCR（iPCR）最早由Sano等人描述，已经成为一种成熟的方法，在医疗保健、医学和免疫学中常规使用，用于检测肿瘤标志物、病毒蛋白、病原体、微生物和毒素等。免疫PCR是基于特异性抗体和核酸分子的嵌合体，作为标记物被PCR扩增以产生可检测的信号。

与ELISA相比，这种方法的检测灵敏度可提高1,000-10,000倍，因为它利用了PCR的信号扩增。

一般来说，iPCR系统与传统的ELISA相似，但采用了与DNA标记物相连接的抗体-酶结合物来代替将底物转化为可检测的产物。通过加入核苷酸、特定引物和聚合酶，标记物被放大以增强产生的信号。产生的扩增子的数量与抗原的原始数量有关。已经开发了许多不同的格式，图1中概述了这些格式。

图1 | 免疫PCR中采用的各种方法示意图

（A）免疫PCR通过（ⅰ）夹心法，（ⅱ）直接法，（ⅲ）允许同时进行iPCR和ELISA的夹心法。

（B）通过（ⅰ）夹心法，（ⅱ）直接法，和（ⅲ）带有生物素化捕获抗体的链霉菌素涂层板，用DNA直接连接到检测抗体的免疫PCR。

该方法自推出以来经历了巨大的改进，并进一步发展为实时版本（rt-iPCR）。这种rt-iPCR方法对扩增的PCR产物进行即时、定量的分析，通过直接监测封闭反应容器中的荧光信号，可用于阐明样品中目标蛋白的数量。这样做的另一个好处是取消了额外的扩增后分析步骤，也减少了污染的可能性。

虽然iPCR经常受到灵敏和特异性抗体要求的阻碍，但使用这种技术可以获得巨大的好处。这包括减少所需的样本量，甚至有可能使用替代的样本基质，增加的灵敏度可能允许在以前不可行的地方进行检测，避免了为获得检测样本而进行的侵入性程序。然而，由于需要昂贵的设备，该方法在护理点的应用受到一定限制。

2.2、杂交链反应

一种被称为杂交链反应（HCR）的核酸扩增方法已经被描述出来，它有可能允许使用一对互补的、动力学捕获的发夹式寡聚物进行特定的、「无酶」的延伸。

最近，已经描述了一种适应HCR的方法，即用于检测单细胞分泌的待测物的免疫HCR，它提供了一种替代方法，如酶联免疫吸附点（ELISPOT）或滚动循环扩增（RCA），后者分别在时间和特异性方面受到限制。

图2所示的免疫HCR，利用一对核苷酸为基础的启动子，与特定的抗体相连接，与直接用荧光团标记的抗体相比，改善了对免疫细胞分泌的趋化因子或细胞因子的检测。

观察到灵敏度提高了200倍。这一点，再加上容易与处理微阵列的既定做法相结合，以及多重检测的潜力，使免疫HCR成为一种有希望的等温、不依赖酶的方法，用于放大夹心法中捕获的蛋白质的微观斑点的信号。

图2 | 免疫-HCR的示意图

涂有抗体的玻璃表面可以捕获感兴趣的分析物。引入用寡核苷酸引发剂标记的二级抗体，并与目标分析物结合。荧光标记的DNA毛细管随后与它们互补的寡核苷酸起始物杂交。在HCR过程中，每个结合的抗体的荧光信号随着带有荧光团的发夹的增加而增加。

2.3、环介导等温扩增法

环介导等温扩增法（LAMP）是一种核酸扩增方法，为检测和鉴定疾病提供了一种快速、准确和具有成本效益的诊断工具。

LAMP是一种高度灵敏和特异的一步扩增方法，在等温条件下扩增目标DNA序列。该方法采用Bst DNA聚合酶，它表现出链置换活性，通过扩增目标DNA中的六个远端区域而发挥作用。只有当目标DNA中的所有六个区域都被引物识别时，才会发生扩增，这就赋予了它高度的特异性。

LAMP方法有许多特点，使其优于其他类似方法。首先，与其他基于PCR的方法不同，LAMP不需要高精度的热循环设备，因为它使用的是等温酶。其次，简化的反应发生在一个试管中，可以通过浊度或荧光等多种方式监测和确认阳性反应，不需要复杂或耗时的扩增后分析。

这些特性使LAMP成为一种非常有吸引力的方法，用于在没有复杂设备和高技能人员的情况下诊断疾病和感染。Lee等人描述了LAMP方法的一个非常有趣的修改，概述了用于检测病人样本中结核分枝杆菌的反转录环路介导的等温扩增-酶联免疫吸附杂交（RT-LAMP-ELISA）测定。

通过这种技术，作者详细介绍了一种快速、「单管」检测患者活动性肺结核的方法，以及从单个痰样中区分结核杆菌和其他分枝杆菌的能力。

光学检测依赖于吸光度、荧光或发光的读数，有许多仪器（如平板阅读器和玻片扫描仪）可供选择，这些仪器可以方便和快速地进行测量。随着降低现有免疫测定的检测限和提高灵敏度的动力不断增强，新的检测策略也在不断发展，特别是在荧光检测领域。下面将讨论一个创新的荧光检测方法及其应用的例子。

其他基于全内反射的光学检测方法，如全内荧光（TIRF）、全内反射椭圆仪（TIRE）和纤维光学的使用，已被描述为改善信号检测的方法。超临界角荧光（SAF）被描述为一种光学检测方法，与其他检测系统相比，可以提高灵敏度。

它基于图3所示的原理，即入射光线在水玻璃界面上被折射成低于临界角的角度，这意味着没有光线应该进入超临界角。然而，与玻璃表面结合的荧光体可以向超临界角发射。通过扣除发射到非临界角的光，只有靠近表面的荧光团可以被选择性地检测到。

一个简单的抛物线元件可以通过「无损失」的全内反射（TIR）将SAF转换成方便检测的平行光线。

图3 | 位于水-玻璃界面的分子的荧光强度在所有可能的发射偶极方向上的平均角度分布。图片改编自Kurzbuch等人[54]。

高收集效率和只收集靠近检测表面的分子而不是散装溶液的荧光的能力相结合，为免疫测定的灵敏读出提供了一个有用的系统。SAF技术出色的信噪比已被用于单分子检测、荧光显微镜和荧光相关光谱学。

据Ruckstahl等人说，与TIRF相比，SAF有几个优点。首先，TIRF需要一个非常高的角度照明，而SAF可以在临界角以上的任何角度实现出色的表面封闭。其次，在适度的表面角度激发样品的能力允许在水溶液中同时进行检测。

此外，由于直接的检测光学元件，它有可能通过聚合物注塑法低成本地生产。Kurzbuch等人描述了超临界角荧光芯片阅读器的使用，它可以提供一个低成本、高灵敏度的生物芯片扫描系统，能够应用于医疗点环境。