胶体金检测试剂作为体外诊断试剂的一个重要组成部分，具有成本低廉以及快速便捷等特点，广泛应用于临床检测、食品安全检测、环境监测、农业和畜牧业以及毒品检测等领域。然而，胶体金试纸条也存在一些固有的局限和不足，如变异系数（Coefficient of Variation, CV）较大（约为10%~20%）、线性范围窄和灵敏度低等。

如何控制胶体金纸条的CV是胶体金试剂领域的老生常谈了，也是长期困扰研发和生产控制的一个话题。本文中，笔者将结合自己的研发经验，从胶体金颗粒的均一性和结合垫的处理工艺这两点出发，来跟大家聊聊胶体金试纸条CV的控制。

胶体金颗粒的均一性

在胶体金试纸条中，胶体金作为标记抗体的显色载体，是制备胶体金试纸条的一个关键工艺点。由于胶体金的颜色和其粒径大小相关，因此胶体金颗粒的粒径大小及颗粒的均一度能够直接影响胶体金试纸条的分析性能参数，如重复性和批间差等。

金颗粒的常用制备工艺为柠檬酸三钠还原氯金酸，根据柠檬酸三钠和氯金酸的不同质量比对纳米金颗粒的粒径进行控制，一般可以形成20~150nm的胶体金颗粒。在纳米金颗粒的形成过程中，反应体积、搅拌速度、反应温度、搅拌器类别、氯金酸终浓度以及柠檬酸三钠和氯金酸的添加顺序和添加方式均可对胶体金的粒径均一度产生影响。因此，胶体金制备完成后需经过质量检定后才能应用于后续工艺。通常选用透射电镜和可见光比色法进行质量检定。但是，透射电镜方法虽然直观可靠，但是由于其设备昂贵，且测定费时且费用较高，不便于研发实验室和生产的日常应用，因此可采用可见光比色法进行胶体金颗粒的质量检定。

我们以柠檬酸三钠的不同加入方式为例，观察其对胶体金粒径均一性的影响。对胶体金溶液进行400nm~750nm范围的吸收光谱扫描，如图1可见光吸收光谱所示，若主峰宽度越小，颗粒越均匀，反之，主峰宽度越大，颗粒越不均匀。图中蓝色吸收峰为：在250mL反应体系中，先加入氯金酸（使其终浓度为0.01g/100mL），待溶液即将沸腾时加入终浓度为0.01g/100mL的柠檬酸三钠溶液（柠檬酸三钠储液浓度为1g/100mL，添加体积为2.5mL）；图中绿色吸收峰为：在250 mL反应体系中，先加入氯金酸（使其终浓度为0.01g/100mL），待溶液即将沸腾时加入终浓度为0.01g/100mL的柠檬酸三钠溶液（柠檬酸三钠储液浓度为5g/100mL，添加体积为0.5mL）；两条吸收峰的区别仅为柠檬酸三钠的加入体积有所差别，绿色吸收峰其主峰宽度小于蓝色吸收峰，说明绿色吸收峰比蓝色吸收峰的粒径更加集中和均一，提示在绿色吸收峰的胶体金制备过程中，加入高浓度、小体积的柠檬酸三钠，能够使柠檬酸三钠以更加快速、均一的方式参与到氯金酸的还原反应中。两种不同添加方式产生的胶体金粒径也稍有差别，绿色和蓝色的最大吸收峰分别为527.86和528.80，根据彭健淳[1]等人的公式计算，两者的粒径分别为31和33nm。

以上是在250mL的较小反应体系中进行的试验，如果应用在企业生产中，在制备5L或10L的胶体金溶液时，不同的添加方式所产生的吸收峰差异可能会更加显著。因此，研发人员在胶体金的制备工艺中，可从柠檬酸三钠和氯金酸的添加顺序及添加方式、反应温度、搅拌速度、搅拌器类别等方面进行优化，从而制备粒径更加均一的胶体金溶液。

结合垫的处理工艺

胶体金试纸条基于侧向流层析原理，样本加入到试纸条远端的样品垫上，通过毛细作用侧向移动，在结合垫上与胶体金标记抗体或抗原发生特异的反应。结合垫是承载胶体金-抗体复合物的薄膜介质，一般材质为玻璃纤维素或聚酯纤维，可选择性的对其进行预处理或不处理。预处理工艺包括浸泡或喷涂等，即用含有缓冲盐（Tris，PBS等）、大分子聚合物（聚乙二醇-4000，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等）、惰性蛋白（牛血清白蛋白，卵清蛋白，酪蛋白等）、蛋白保护剂（海藻糖，蔗糖等）、表面活性剂（Tween-20，Triton X-100等）等成分的溶液对膜材进行浸泡或喷涂，并进行干燥。

膜材的选择、膜材是否需要预处理、预处理缓冲液的组分、膜材预处理液的喷涂工艺方法、以及膜材预处理的干燥工艺方法均是影响CV的因素。这个议题复杂且庞大，本文我们仅选用膜材预处理液的两种不同预处理方法略展开讨论，其他有关CV影响因素的讨论我们将在后续推文中持续更新。

预处理的目的是封闭膜材本身的蛋白结合位点并提供胶体金-抗体复合物的附着骨架，使喷涂于膜材的胶体金-抗体复合物在样本流过时，能够迅速地被溶解并从膜材释放以顺利进行侧向流层析和免疫反应。预处理膜材看似是一个简单的工艺步骤，但是却引入了不均一的可能，并有可能增加试剂条的CV。

基于玻璃纤维素膜，笔者分别采用浸泡和自动喷膜仪喷涂两种预处理方法进行了如下试验：

向预处理液中添加了少许色素（色素仅在此起直观的展示作用，研发生产中不添加），按照浸泡的工艺将整张膜材浸入预处理液中充分润湿，再将膜材放入37℃烘箱干燥16h。如图2所示，色素指示剂提示膜材上的溶液在干燥过程中发生了很明显的边缘效应（红框标识），提示该区域预处理液中成分浓度高于其他部位。同时，由于浸泡法是过饱和原则，预处理体积大于膜材的液体承载量，膜材在浸泡后转移过程中容易导致液分布不均，进而导各种组分浓度不均。

图 2  结合垫浸泡法处理染色示意图

以胶体金定性试纸条为例，CV较大的试剂条会影响胶体金试剂条显色判读，易出现假阳性或假阴性结果，影响试剂条的质量。图3为本实验自制新冠试纸条(抗体货号: 3CV4，配对: C715 - C706），采用浸泡法预处理结合垫，检测样本为50pg/mL新冠病毒重组N-蛋白，重复检测10个试纸条，图中红色箭头所示试纸条显示假阴性结果，其余9个为阳性结果，且个别试剂条显色不均匀，有断点现象，提示该组试剂条的CV较大、精密度略差。

图3 新冠抗原试纸条检测重组N-蛋白（50pg/mL）

（浸泡法处理结合垫）

图4采用自动喷膜仪以5μl/cm喷量逐条喷涂，同样是37℃干燥16h。由于喷涂法中喷涂于单位面积膜上的溶液喷量固定且体积较少，因此每条喷涂处理垫相对比较均一且干燥迅速，可以有效改善结合物释放时的CV。

图 4  结合垫喷涂法处理染色示意图

仍然以自制新冠抗原试纸条(抗体货号: 3CV4，配对: C715 - C706）为例，图5中自制试剂条中采用了喷涂法预处理结合垫，其他条件同图3一致，该组10个检测卡均显示阳性结果，且显色均匀一致，没有出现假阴性结果，提示该组试剂条CV较小、精密度较好。

图5 新冠抗原试纸条检测新冠重组N-蛋白（50pg/mL）（喷涂法处理结合垫）

参考文献