来源：白话胶体金 

烧制胶体金的步骤

（一）操作：烧万分之一金，40-50nm左右。

1.用18.2兆欧水将氯金酸配制成1%的溶液，可以分装保存。再取1%的溶液1ml置于干净的烧杯或锥形瓶中，加水稀释成100ml（即0.01%，俗称万分之一金）。

2.在容器液面处做好标记，磁力搅拌器加热并快速搅拌，待初沸，一次性快速加入1%的柠檬酸三钠溶液1ml（加液的工具比如枪头、注射器等要清洁），持续搅拌。

3.接下来就是等，可以观察到明显的颜色变化，黄（氯金酸颜色）→灰黑（浑浊）→红（透亮），大概的趋势是这样的。变透亮的红色后可以停止加热，适当低速搅拌几分钟，冷却。

4.冷却后，补水至标记处，避光待用。无需过滤，常温和冷藏存放均可，不可冷冻。

（二）讨论：

1.原料：氯金酸，也叫氯化金、四氯金酸，一般含有结晶水，分子式HAuCl4或者AuCl3·HCl·XH2O。氯金酸对金属有腐蚀性，所以要用塑料药匙，他特别吸潮，所以直接用容器称量而不要用称量纸。为避免吸潮的影响，最好将整支氯金酸直接配制成1%的水溶液，再分装避光保存，可以-20℃避光冻存，纯化学物质，冻存主要是防止污染和长菌。

2.配1%的溶液步骤：这里是常用的质量百分比说法，1%氯金酸溶液就是1g氯金酸固体+99ml水。不用管氯金酸的厂家、纯度、结晶水数量、金含量等，就是氯金酸直接称重。但是需要注意的是，因为有上述差异的存在，不同厂家的氯金酸，在相同配比下，烧出来的金子粒径大小会有差异。

3.水：盐离子对胶体金稳定性有破坏作用，因此最好用18.2兆欧水（电子行业所称的超纯水），没有这种制水设备的话用三蒸水，实在不行的话，据说也可以用娃哈哈纯净水。

4.器皿：因为胶体金有洁癖，所以器皿需要彻底清洁（可以泡铬酸）。早期的论坛帖子都说为了防止玻璃器皿吸附胶体金，要硅化处理，硅化试剂有毒，咱们只是烧胶体金，又不是炼黄金，没必要把小命搭上，如果怕胶体金吸附在玻璃器皿壁上，可以先小量烧一点胶体金，然后固定容器烧金，相当于用胶体金代替硅化来封闭器皿表面。

5.加热工具：制备胶体金，温度在95℃以上即可反应，一般控制在100℃左右，过高的温度可能导致加热接触点的胶体金脱水死金，最终会在胶体金溶液表面漂一层油状物。常用的加热磁力搅拌器、加热套、电炉、微波炉等。出于控温的考虑和搅拌的要求，少量研发推荐用加热磁力搅拌器。

6.加液顺序：有上述加完氯金酸后加热，待沸腾后再加柠檬酸三钠的；也有先煮水，沸腾后再加氯金酸，之后再加柠檬酸三钠的；还有先加柠檬酸三钠再加氯金酸的，感兴趣的可以都尝试一下。不管哪一种加液顺序，都要求迅速加入、迅速混匀。

7.搅拌和控温：理论上，初始反应时，需要液体中试剂充分分散均匀、且各点反应温度相同、且同时发生反应，这样所有的晶核将在瞬间同时形成，最终形成的胶体金颗粒将具有同样的粒径。说起来容易做起来难，但这至少指明搅拌和控温在胶体金制备中有很重要的影响，尤其在大量煮金的时候，液柱高度、沸腾程度、加液时机、加液顺序和方式、反应温度、搅拌速度等等都需要研究优化。

8.补水：加热沸腾必然会流失一部分水，我们可以采用上面的做标记最后补水的措施，也可以在瓶口盖块玻璃片防止水蒸发流失。

9.胶体金的粒径与颜色：一般文献中都会出现如下一张表，虽然不一定准确，但也提供了一些信息。

首先，胶体金粒径和还原剂的加入比例有一定的关系，还原剂越多，胶体金粒径越小。

其次，不同粒径的胶体金最大吸收峰不一样，其颜色也不一样。有人会好奇为什么不同粒径胶体金颜色不一样？胶体金显示的颜色，是其吸收光的互补光颜色，说起来比较拗口，其实这是一个物理问题。

如光谱图所示，不同波长的可见光颜色不一样，我们熟悉的日光，包含全部这些可见光以及不可见的红外和紫外光。也就是这些有色光混合之后可以变成无色的白光。

某一种颜色光和另一种颜色光混合之后变成白光，这两种光就是互补光色。如下图：

平时肉眼看物体之所以显示颜色，是因为日光（白光）照射之后，有的被吸收了，有的被反射回来了，我们看到的是反射光颜色，也就是吸收光的互补光颜色。

回过头来，我们再看一下常见的胶体金分光光度计扫描图，不同粒径的胶体金，虽然都是由金原子组成，但是不同粒径的原子排列是不同的，因此其对白光有不同的吸收表现，比如小粒径的金，其主要吸收500nm左右的蓝绿光，就会显示出互补的红色，而粒径增大之后，吸收峰红移，吸收540nm左右的绿光，就会显示出互补的紫红色。

胶体金准备好了，在标记蛋白之前。需要根据检测目标物，来选择一种适用的检测模式，然后再来筛选合适的原料和工艺，而检测什么东西，该用何种检测模式，这需要了解一定的基础原理和具体项目的背景知识。这一话，我们先聊一聊免疫层析的一些概念。

我们先从一个产品名字说起：《人绒毛膜促性腺激素（HCG）检测试剂盒（胶体金免疫层析法）》京械注准20122400225。这个是比较规范的命名方式，其中“人绒毛膜促性腺激素（HCG）”表示待测物，括号里是英文缩写，找原料也经常用英文缩写。

“检测”两个字表示这是一个定性试剂盒，如果是定量试剂盒的话，叫“测定试剂盒”，法规规定正式名称里不能出现定量、快速等字眼，有这些字眼的基本都是历史遗留问题。

“胶体金免疫层析法”是检测的方法学，这个是目前最不统一的地方了，有叫“胶体金法”的，有叫“免疫层析法”的，有叫“干式免疫层析法”的，胶体金还算好的，加上荧光更加乱套，可以叫荧光法、免疫荧光法、免疫荧光层析法、荧光免疫层析法、干式免疫荧光层析法、干式荧光免疫层析法……，再加上时间分辨荧光、量子点等等，叫法很不统一，这还不是最难受的，难受的是当你去国家药监局网站查询同类厂家的时候，会发现方法学这里中文的（）和英文的()搜索出来的结果还不一样，支付宝都扫不到的福，在这服了。

“京械注准”表示北京药监局批准注册的医疗器械产品，二类产品一般都在省局注册，如果是进口的二类是国家级批准的。“2012”是注册年份，后面接的2表示第二类，再后面的40表示这是6840分类（临床检验分析仪器）。再后面的0225是药监局注册的流水号。公司领证值得庆祝，这里留个彩蛋，20120225是我个人领证的喜庆日子。

下面再来说一下什么是胶体金免疫层析法？我们一个一个的名词拆解开来：

胶体金：前面已经说过，他的作用是指示剂/示踪剂，形成肉眼可见的信号，表明这里发生了反应。类似的指示剂可以换成彩色胶乳、荧光微球等。

免疫：内在原理，基于抗原抗体特异性结合的免疫学原理。这个留到下一话讲解。

层析：外在形式，利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。在这里，分配比例不同是我们通过免疫结合实现的。

下面以HCG举例，先看一个动图演示：

待测的液体样本是流动相，从样品垫处开始层析。

到结合垫处，样本中HCG会与胶体金标记的α-HCG抗体结合；这里的抗体叫labeling antibody，因为他标记了东西；也叫detecting antibody，因为他偶联了一个可以形成信号的标签，用来检测样本中是否存在待测物。

继续层析到NC膜上，HCG的另一个位点被T线的β-HCG抗体结合，HCG即从流动相（样本）分离到了固定相（NC膜）上，形成βHCG抗体-HCG-αHCG抗体（胶体金）这样一个三明治夹心的复合物，出现肉眼可见的红色线条，为阳性结果。如果样本中无HCG，则金标抗体不会在T线形成三明治夹心，就不会有T线。这里的抗体叫coating antibody，因为是包被在固相上的；也叫capture antibody，因为他从流动相中捕获待测物。

无论样本中有无HCG，过量的胶体金标记α-HCG抗体都会随样本继续层析，而C线的羊抗鼠IgG会无条件的结合胶体金标记α-HCG抗体（鼠单抗）的Fc段，形成肉眼可见的红色线条，C线虽然叫质控线，但仅代表层析过程正常，如果不出C线则需要重新测试，但是有C线并不能代表结果是准确的（这是后话，也是研发头疼的地方）。

流动的液体最终会被顶端的吸水纸吸收，吸水纸承载能力强，保证样本充分层析并减少回流（逆向层析）的现象。

C、T线抗体都是包被在NC膜上的，他是整个反应的基台，除去抗原、抗体本身外，在所有组件中，NC膜对产品的性能影响最大。

以上组件都是粘贴在PVC胶板上的（也有PS材质的），再加上MAX胶、手柄纸或卡壳，一个完整的层析产品就出来了。

那为什么会发生层析？我们先来看一个现象：毛细作用

为什么液体会上升，为什么玻璃管越细上升的越高？这里有两个物理概念：

浸润：浸润液体在固体表面倾向于展开，因为亲水固体分子对水分子的引力大于水分子之间的引力，液体则倾向于沿固体表面展开。

表面张力：与液体内部相比，液-气界面处液体分子间距大，分子间斥力减弱，分子相吸促使液体表面缩小，这个力叫做表面张力。

在毛细作用中，管壁处液体浸润形成了凹液面，表面张力促使凹液面恢复平直，表现为向上的合力，带动管中液体上升，上升的力被重力抵消后，液面即停止上升，因此管径越细，相同重量的液体会升的越高。

而我们使用的NC膜、样品垫、结合垫、吸水纸等材料，都具有多孔毛细管结构，又是亲水材料（或经过亲水处理），因此液体样本能在上面层析。层析产品一般加完液会平放，样本不需要抵消重力，从左到右的使劲跑，所以又叫侧向层析lateral flow，当然同时也有纵向的层析发生。

有些产品一直直立浸在液体里检测，这么多的毛细孔也能保证样本抵消重力顺利层析到吸水纸，最终跑上去多少液体取决于试纸条这些组件的满载吸水能力，喝饱了也会撑着。

需要注意的是，除了胶板，每个组件都具有一定的吸水能力，好处是吸收水并使之层析，坏处是会存水和逆向层析。对于滴加样本的检测方式，一般在70-100ul左右，加样体积不够时，不足以将金子全部冲刷到吸水纸，就不能顺利的完成检测；而一次加太多样，超过样品垫的承载能力，可能会发生溢液的情况，样本的不规则层析，导致金子释放出问题，进而线条会乱七八糟的。

而逆向层析，是指完成检测后，时间长了，液体会从吸水纸往样品垫端流动，严重时导致条子背景不干净，甚至由阴性变假阳的结果。其实时间也没多长，30min左右就开始了，并不是等下面的组件都干了之后才反流，只不过造成明显后果可能需要一两个小时以上了。

结合图示，大概的把免疫层析试纸条的主要组件和基本功能介绍了一下，想要详细学习了解，可以去网上找一下相关资料，比如NC膜有很多厂家的培训资料，也有不少的文献研究，后面写NC包被的时候，我也会写一些NC膜的理论知识。 

还有不同材质的东西，吸水速度和蓄水能力也不同，同一材质不同厚度性质亦有差异，这些一般耗材厂家都会提供一些参数。对我们的实验来说，可以更换不同材质的组件实现一些小目的，比如用薄聚酯加快样品垫吸液速度或金垫释放速度，用厚玻纤提高样品垫承载能力防溢液等。胶板虽然不吸水，看似跟样本层析不搭边，但是对于一个固定的卡壳，尝试不同厚度的胶板也可以改善层析过程，当时有条件还是优化或筛选更好用的卡壳。

来源： 白话胶体金