本研究方案代表了一个标准的捕获或ELISA夹心法的例子，使用生物素化的检测抗体和链霉亲和素-HRP间接法系统，使用常用的试剂和TMB（四甲基苯）底物。

1.1、硬件设备

➤   透明的96孔板；

➤   带一次性塑料吸头的多通道精密移液器；

➤   配备有检测底物的平板阅读器或发光仪。

1.2、试剂

通常情况下，标准曲线的浓度可以从0到1000 pg/mL，但也可能高达3000 pg/mL，这取决于样品中抗原的预测量和标准蛋白的数量。

通常情况下，使用标准稀释剂从储备液中制备标准蛋白的2倍或3倍稀释液。在制备蛋白质标准品的连续稀释液时，每次稀释后要使用新的吸头。 

                                                   3、样品的制备

如果样品中的抗原浓度可能超过标准曲线的最高点（即 > 1,000 pg/mL），则使用标准稀释液制备一个或多个样品稀释液。

重点：在任何时候都不要让平板干燥。

1.   将捕获抗体稀释到适当的浓度，使每孔有足够的体积为50 ~ 100 μL。

2.   将稀释后的捕获抗体加入板中，盖上盖子，在室温下孵育2小时。

3.   取出溶液，用每孔200 μL的洗涤缓冲液在摇动平台上洗板3×5分钟。

4.   每孔加入300 μL封闭缓冲液，盖上板子，室温下孵育1小时。可以在4℃下封闭过夜。

5.   准备好样品和标准品。每孔的体积应与步骤1中使用的捕获抗体相同。

6.   移除封闭缓冲液，加入样品和标准品。盖上板子，在室温下孵育1小时。

7.   取出溶液，用每孔200 μL的洗涤缓冲液在摇动平台上洗板3×5分钟。

8.   将生物素化的检测抗体稀释到适当的浓度。每孔的体积应与步骤1中使用的捕获抗体相同。

9.   将稀释后的检测抗体加入板中，盖上盖子，在室温下孵育1小时。

10.   取出溶液，用每孔200 μL的洗涤缓冲液在摇动平台上洗板3×5分钟。

11.   将酶结合物稀释到适当的浓度。每孔的体积应与步骤1中使用的捕获抗体相同。

12.   将稀释后的酶结合物加入板中，盖上盖子，在室温下孵育1小时。

13.   取出溶液，用每孔200 μL的洗涤缓冲液在摇动平台上洗板6×5分钟。

14.   将底物溶液加入板中。每孔的体积应与步骤1中使用的捕获抗体相同。

15.   在室温下孵育平板，直到达到理想的颜色强度。理想情况下，标准品会产生一个清晰的梯度。

16.   加入等量的终止液来停止反应。

17.   如果使用TMB，在450 nm处测量吸光度。对于其他底物，使用适当的检测技术。