我们对肿瘤生物学的理解已经发展到我们现在知道肿瘤微环境（TME）对肿瘤的侵袭性和持久性非常重要。

这些肿瘤特征不仅受TME的细胞元素影响，如免疫细胞和成纤维细胞，而且还受ECM的非细胞、基质元素影响，其中许多是碳水化合物而不是蛋白质。

例如，透明质酸（HA）是一种普遍存在于细胞外和细胞周围基质中的糖胺聚糖，作为实体瘤侵袭性的一个重要因素，并因此作为一个可能的药物靶点，已经获得了特别的关注。作为一种基于碳水化合物的生物标志物，HA与蛋白质生物标志物有明显的不同，而蛋白质生物标志物到目前为止一直是c/CDx测定的重点。

1934年，Meyer和Palmer在牛眼的玻璃体中首次发现了HA，它是由重复的葡萄糖醛酸-N-乙酰葡萄糖胺二糖单元组成的带负电的线性聚合物。尽管HA存在于整个身体的ECM中，但它在玻璃体、关节软骨和皮肤中的含量最高。

在这些组织和其他组织中，它最初被认为只是ECM的一个结构成分，为组织提供机械强度。最近，许多证据表明，它还通过与细胞表面受体CD44和RHAMM（透明质酸介导的运动受体）结合，在胚胎发生和伤口愈合中介导细胞信号。

对HA作为癌症生物标志物的兴趣始于对各种实体瘤中HA含量异常高的观察，包括乳腺癌、前列腺癌和胰腺导管腺癌（PDA），并随着肿瘤中HA含量的升高和肿瘤的侵袭行为之间的关联变得明显。

据推测，HA的积累可以通过以下方式促进肿瘤友好环境的形成（包括其他机制）：增加间质流体压力，从而减少血管通畅性和化疗药物进入肿瘤细胞；与CD44和RHAMM结合，从而激活致癌细胞信号通路；以及在肿瘤细胞上形成一个细胞周围「外套」，从而降低其免疫原性。

这些假定的HA的作用表明，降低其水平可能使TME对肿瘤不那么友好。大量的临床前和临床证据支持这一假说。

对HA在肿瘤持久性和侵袭性中的作用的进一步了解，导致了各种具有不同作用模式的HA靶向实验药物的开发。

例如，methylumbelliferone通过耗尽HA前体的供应来抑制HA的合成；mertansine抑制HA与RHAMM和CD44的结合，防止某些致瘤途径的下游激活；PEG-PH20（PH20的一种聚酰化形式，负责生理性HA降解的透明质酸酶之一）增加肿瘤基质内的HA分解。

PEG-PH20治疗被认为可以减少HA引起的肿瘤基质的畸变，从而（最重要的）恢复血管的通畅。这反过来又改善了全身性药物对肿瘤的渗透，并改善对这些药物的反应。

RTD正在开发一种亲和性组织化学CDx测定法，用于测定PDA（在高达87%的病例中观察到HA的积累）、胃癌、乳腺癌、NSCLC和胆道癌的HA。HA CDx测定是基于最近推出的已经上市的用于测定肿瘤组织中HA含量的Ⅰ类测定（VENTANA HA Dx测定）。

VENTANA HA Dx测定法的发展故事在几个方面是独特的。首先，作为一种在脊椎动物中高度保守的碳水化合物，HA的免疫原性很弱，这与许多蛋白质生物标志物不同。

因此，按照传统的模式，通过初级mAb测定HA是不可行的。测定生物液体、细胞和组织切片中的HA的先验研究使用了一种生物素化的、天然存在的HA结合蛋白（HABP），即从牛软骨中纯化的b-HABP。然而，由于担心其特异性、纯度和批次间的差异性，这种蛋白被认为不适合开发成IVD。

VENTANA HA Dx测定依赖于重组HABP的变体，最初由Jadin等人描述，对FFPE人体组织ECM中的HA表现出高特异性和亲和力。该蛋白结合了肿瘤坏死因子刺激的基因6蛋白（TSG6）天然存在的HA结合域和人类IgG1的Fc受体域。

为了使HABP能够通过其他CDx IHC测定中使用的常规工作流程进行可视化，测定开发团队用兔子的Fc受体结构域替换了HAPB的人Fc受体结构域，创造了一种改良的重组HAPB，命名为「rec-HABP」。

如图1所示，由于rec-HABP的兔Fc受体区域使其功能类似于兔一阶抗体，标准IHC检测系统可用于测定FFPE肿瘤组织中HA结合的rec-HABP。

图1 | 用于测定透明质酸的亲和性组织化学测定。含有兔抗体Fc1b区域的重组HA结合蛋白（rec-HABP）与细胞外基质中的HA特异性结合。用HQ标记的二阶抗体，一种专有的合剂，然后与兔抗体Fc1b区域结合。这种抗体又用HRP标记的抗HQ小鼠mAb进行定位，它将DAB转化为棕色沉淀物。

为了确认rec-HABP的靶标特异性，测定开发团队不得不使用一些在c/CDx IHC测定开发中通常不使用的分析方法。例如，由于HA通常是作为一个非常大的分子（在健康组织中为2 × 10^6 Da）存在，有许多降解产物，Western Blot法不太适合这项任务。因此，使用点阵法来证明rec-HABP不会与硫酸软骨素或硫酸肝素（ECM中常见的其他碳水化合物）发生交叉反应。

rec-HABP对HA的特异性也通过评估用PH20透明质酸酶治疗前后收集的患者的FFPE肿瘤组织（乳腺癌、胃癌、肺癌和PDA）的染色强度差异得到证明。在大多数情况下，这种处理导致HA染色强度下降到背景水平或以下，支持rec-HABP以特定和一致的方式染色HA的前提。

开发HA CDx测定的另一个有趣的方面是，它需要一种新的阴性对照试剂。典型的IHC阴性对照试剂，即非特异性一阶抗体，不能使用，因为该测定使用PIER抗原检索，发现即使使用非特异性抗体也会引起过度的背景染色。为HA测定开发的阴性对照试剂（VENTANA蛋白酶阴性试剂对照）适合在任何使用PIER的类似测定中普遍使用。

目前正在进行的用于预测的HA测定的开发，与对TME作为肿瘤学的一个重要因素的认识同步，特别是对HA作为一个药物靶点的强烈兴趣。因此，开发一种特异的、敏感的、可重复的HA CDx测定既及时又重要。

来源： 诊断科学