根据2001年国际纯粹与应用化学联合会对生物传感器的分类标准，电化学免疫传感器是基于抗原抗体反应的，可进行特异性的定量或半定量分析的自给式的集成器件，其中抗原/抗体是分子识别元件，且与电化学传感元件直接接触，并通过传感元件把某种或者某类化学物质浓度信号转变为相应的电信号。

与常规免疫分析仪器相比，电化学免疫传感器能直接将生物信号转化为电信号，便于检测和处理，无需复杂仪器及操作，仪器简单、价格低廉、测定快速准确、具有足够的灵敏度、适于现场检测。电化学检测过程不受样品颜色和深浊度的影响，并且避免了放射性污染等弊端，无毒害作用。

电化学免疫传感器主要包括安培型（电流型）免疫传感器、电位型免疫传感器、电导型免疫传感器和电容型免疫传感器等，其中安培型免疫传感器的研究报道最多，发展最快。

安培型免疫传感器利用电活性物质把生物亲和反应能转换为电流信号，灵敏度高，适合于痕量检测。1979年Aizawa等第一次报道了用于检测人绒毛膜促性腺激素的安培型免疫传感器。安培型免疫传感器以酶作为标记物，利用标记物酶对底物的催化反应，通过检测特定电压下酶催化底物产生的电流信号实现检测。

电位型免疫传感器结合了免疫分析的高灵敏度和离子选择电极、气敏电极等的高选择性，可以直接或者间接检测各种抗原、抗体。1975年Janata首次报道了电位型免疫传感器，利用聚氯乙烯(PVC)膜将抗体固定于铂电极上，当相应的抗原与抗体特异性结合后，抗体膜中的离子迁移率发生变化，从而导致电极上的膜电位发生改变，根据电位的变化值求出待测物的浓度。离子敏场效应晶体管(ISFET)是离子选择性电极和金属-氧化物-半导体场效应晶体管(MOSFET)相结合的一类特殊的电位型传感器，与传统的离子选择性电极相比，它具有体积小、灵敏度高、响应快、检测仪表简单方便输入阻抗高、输出阻抗低，能够进行阻抗变换和信号放大，可避免外界感应与次级电路的干扰作用等优势。离子敏场效应免疫传感器将免疫检测与FET传感器相结合，在FET的栅极表面固定抗体，抗原抗体结合产生的荷电状态会引起膜电位的变化，利用这种现象实现待测物质的检测。非特异性吸附和背景干扰等问题是电位型免疫传感器需要解决的关键问题。

电导型免疫传感器是基于免疫生化反应产生或者消耗离子引起的溶液导电性的变化实现检测。

电容型或者阻抗型免疫传感器是建立在双电层理论上的一种传感技术，在测试过程中，电极/溶液界面的行为类似于平板电容器，并能储存一定的电荷。物质的吸附和表面电荷的改变将会对双电层结构和双电层电容产生影响，双电层电容的变化可以采用电化学交流阻抗法测定。

如何在信号转换器即工作电极表面上形成合适的生物敏感膜，以固定抗体或抗原，是电化学免疫传感器制备非常关键的步骤。一方面，要求电极与生物敏感膜之间具有良好的生物相容性，保证固定化的抗体或抗原具有较高的生物活性；另一方面，要求生物敏感膜具有合适的空间取向和分布，获得尽可能小的空间位阻，以利于和目标抗原或抗体的结合；同时，形成的生物敏感膜应尽可能地薄，这样可以有效地降低法拉第电流（传感器背景电流的来源之一），以使传感器获得更高的灵敏度。

常用的抗体固定方法有吸附法、包埋法、化学交联法、共价键合法、自组装单层膜法、生物素-亲和素法及蛋白质法等。

（1）吸附法

经非水溶性载体物理吸附或离子结合的作用使生物敏感膜元件固定，称为吸附法，这些结合可能是氢键、范德瓦耳斯力或离子键等，也可能是多种键合形式共同发挥作用。生物分子与载体吸附的牢固程度与溶液的pH、离子强度、温度、溶剂性质和种类以及生物分子浓度有关。为了得到最好的吸附并保持最高的活性，控制实验条件十分重要。

吸附过程比较简单，不发生化学反应，且具有自我调节能力，生物分子的固定量主要受固相表面积、电荷数量和分布的控制，但是，物理吸附是一个可逆的过程，当吸附和解吸附的平衡被打破时，原来被吸附的一部分生物分子就会解吸附离开固相表面，这是典型的热力学过程，无法完全避免。一般来说，生物分子与表面的吸附力越强，解吸附的速率就越慢。使用疏松多孔材料（如硝酸纤维膜、黏土等)或极性材料（如炭黑、金属氧化物等）作为载体，或通过预处理固相表面以增加电荷量等方法可以促进吸附并减少解吸附的可能。但是，在使用过程中，外界环境如离子浓度增大引起静电作用力的改变、载体表面电荷的减少、pH的急速改变以及淋洗速率的突然加大等都有可能引起生物分子的解吸附，从而引起传感器性能的下降。常将吸附法与其他方法结合使用，如吸附交联法、高分子膜吸附法、无机材料吸附法等。

（2）包埋法

包埋法是指将生物分子包埋并固定在聚合物三维空间结构中，常用的包埋法包括溶胶-凝胶聚合物包埋法和电聚合包埋法。

溶胶-凝胶聚合物包埋法是将生物分子与有机或无机化合物（如有机硅酸盐、硅氧烷)混合在一起，经水解、缩聚反应，由溶胶状态逐渐固化而形成三维网络结构的凝胶。由于凝胶网络是根据生物分子的大小而逐渐形成的，因此能够较好地保持生物分子结构的完整性，使生物分子均匀分布在聚合物中。保证目标分折物或底物以及与被包埋的生物分子反应所形成的产物在底液和凝胶网络之间的任意双向扩散是一个关键问题。

电聚合包埋法是指对含有生物分子的单体溶液，在电解作用下，单体发生氧化反应沉积在固相表面形成不溶性高聚物，生物分子在此过程中被包埋在形成的聚合物膜中。该方法的优势在于可以通过一步电聚合实现生物分子的固定，且能够通过控制电压和电流来调节聚合物的形成。有些聚合物具有与半导体甚至金属相比拟的导电性，可以在生物分子与电极表面之间提供一条电子转移通道，不需要介质来传递电子。

综合来看，电聚合包埋法较为简单，能够使生物分子均匀地分布在基质载体中，且不易渗漏，但是在极性有机试剂或电解作用下，蛋白质分子容易变性，活性降低。同时，受基质屏蔽效应的影响，生物分子被包埋在基质载体中阻碍了与目标分析物的结合（或与底物的接触），特别是，分子量较大的目标分析物和底物分子在基质内部的扩散较困难，会影响传感器的灵敏度。

（3）化学交联法

化学交联法是指利用交联剂使生物分子的功能基团与固相载体表面的功能基团形成共价键实现生物分子的固定或在蛋白质分子之间交联形成网状结构。交联剂一般是具有两个功能基团的试剂，因此常被称为双功能试剂，它们能够与生物分子的氨基、羧基、巯基和羟基发生共价交联。

戊二醛是最常使用的双功能试剂。戊二醛两端均含一个醛基，能够与蛋白质分子中的游离氨基形成席夫碱(Schiff base)，分子结构的中间部分为五个碳原子以单键相连，分子柔性较大，在参与蛋白质分子的交联反应时，能够在不同的蛋白质分子之间形成空间网状结构。

戊二醛的分子结构

该方法操作简单，使生物分子与载体的结合更牢固，但是膜的形成条件需严格控制，如pH、温度、离子强度及反应时间。pH一般控制在蛋白质的等电点附近。交联膜的厚度和戊二醛的含量对传感器的响应也有较大影响，较厚的膜不利于扩散，致使响应信号下降，响应时间延长；过低的戊二醛浓度不易使蛋白质溶液固定化，过高的戊二醛浓度又会使蛋白质失活。而且，戊二醛在储存和使用中会发生缩合和部分环化反应，降低固定效率，影响产物的重复性。另外，双功能试剂的交联不具有选择性，既可能发生分子间交联，又可能发生分子内交联。

（4）共价键合法

共价键合法是利用生物分子结构中的功能基团与固相载体表面的功能基团形成化学共价键的连接而实现固定化，通常要求在低温、低离子强度和生理pH条件下进行。

固相载体表面经过等离子体刻蚀、电化学处理或化学试剂（如硅烷等)活化后形成一系列活性基团，这些基团可以直接与生物分子的相应功能基团发生共价键合反应，实现生物分子的固定化。当然，也可以借助于双功能试剂将生物分子交联在活化后的载体表面。共价键的强度比静电力、供体-受体作用力和氢键力高很多，所以，共价键的结合稳定性最强，能够抵抗很多外部因素的干扰。

（5）自组装单层膜法

自组装单层膜(self-assembling monolayer, SAM)法是目前免疫分析体系中研究较为广泛的一种抗体固定方法。该方法利用两亲分子反应活性头基与固相界面之间自发化学吸附作用而形成的高度有序的单层膜，借助于分子末端活性基团，通过共价键合来固定生物分子。

常用的自组装单分子层是利用烷烃硫醇通过Au-S键在Au表面形成烷烃硫醇自组装单层膜。一般认为Au-S键的形成分为两步：第一步是S-H键氧化加成到Au表面并还原生成氢；第二步是通过烷烃硫醇链之间的范德瓦耳斯力使链之间形成偏离正常键角20°~30°的倾斜角。

自组装单分子层表面可以包含羧基、氨基等基团，这些基团能够与抗体分子形成共价结合从而将抗体固定化，而且利用自组装单层膜的高度有序性能够控制抗体的固定位置，使其稳定性较好。但是，一维自组装单层膜结构容易在固定的抗体之间形成较高的空间位阻，在一定程度上阻碍了抗体活性结合部位对抗原的特异性识别，降低了传感器的灵敏度，而且自组装膜具有较强的刚性，与蛋白质分子间的生物相容性较差，因此需要进一步通过使用不同链长的烷烃硫醇或引入活性纳米颗粒来改善膜的空间结构和亲和性。

（6）生物素-亲和素法

生物素和亲和素均来自于动、植物组织中，二者之间极高的亲和力是目前已知强度最大的非共价结合作用，结合物的稳定性好，不受温度、pH、试剂浓度及蛋白变性剂等化学试剂的影响，其解离常数为10^-15mol/L。一个亲和素分子能够结合四个生物素分子，利用这一特点可以构建多级信号放大系统。

亲和素带有一个糖链侧链，容易和细胞表面的多糖发生非特异性结合，使用链霉亲和素可以避免此问题发生。该方法已经广泛应用于免疫分析体系抗体固定过程中，一种形式是先将链霉亲和素固定在修饰电极表面，生物素标记的抗体通过生物素-亲和素的特异性结合实现固定。

（7）蛋白质法

利用蛋白质结合抗体实现抗体固定是一种常用的基于亲和作用的固定化技术。来自金黄色葡萄球菌的蛋白A和来自链球菌菌株的蛋白G是最常用的两种蛋白质。固定在固相载体上的蛋白A和蛋白G能够直接与IgG分子结构的Fc区域结合，使抗体的活性结合区Fab远离固相表面，便于和抗原结合。但是如果蛋白A和蛋白G在固相表面的排布是随机的，可能会降低其与抗体的结合效率。另外，蛋白A对不同生物体来源的IgG的亲和性相差较大，如对山羊和大鼠的IgG无亲和性，对小鼠IgG只有比较弱的结合力。

如何将生物活性组分（抗体）有效地固定在电极表面，减少甚至消除蛋白质在传感器上的非特异性吸附，提高免疫传感器的重复性和稳定性是发展免疫传感器的关键问题。目前，研究者越来越多地认识到：在生物敏感膜的固定化过程中，解决抗体的空间取向性问题至关重要。这是由于抗体本身的结构或活性部位具有不对称性和多重性，在电极表面无取向地固定抗体很容易引起在抗体的抗原结合部位形成很高的空间位阻，使固定化抗体不能有效地捕获待分析抗原，从而降低固定化抗体的有效活性。

有效地将抗体固定在电极表面是构建性能良好的免疫传感器的关键步骤，因此新型的抗体固定化技术层出不穷：

①利用聚合物材料的水溶性对pH敏感的特点，通过电化学氧化或还原方法，改变电极表面附近溶液的pH，引起聚合物的溶解度的改变，使聚合物沉积在电极表面，生物识别分子随聚合物沉积在电极表面而完成对生物组分的固定，具有重复性好、生物组分活性高等特点；

②利用微型化的电喷涂(electrospraying)技术进行生物分子组分的固定，具有微样量、多位点固定多种生物活性物质、不易发生交叉干扰、活性高、重复性好等特点；

③基于光异构化的半抗原单分子层电极，发展可重复使用的安培型免疫传感器；

④利用磁性纳米颗粒，采用电磁性的电极，可以方便地完成对生物识别分子的固定，固定方法简单、重复性好。

电化学免疫传感器不仅能够用于临床疾病的检测，而且能够用于环境监测、食品安全等众多领域。例如，早期Liu等研制了基于石蜡包埋生物组分的可更新碳糊电极的安培型免疫传感器来检测日本血吸虫病抗体；Meusel等用安培型免疫传感器测定了血清中阿朴脂蛋白E的含量；Vetcha等发展了便携式电化学免疫传感器检测Hanta病毒抗体；Benders等和Hamid等分别采用电化学免疫传感器检测水中多氯联苯和大肠杆菌；Lin等和Zhang等采用电化学免疫传感器检测了黄曲霉毒素；中国科学院电子学研究所传感技术国家重点实验室利用抗原-抗体结合物阻碍电子传递而减小电流响应的原理，研制了用于黄曲霉毒素检测的无标记电化学免疫微传感器。

电化学免疫传感器由于具有操作简单、快速、灵敏度高等特点，应用领域越来越广泛，其发展趋势有以下几个方面：

（1）微型化

依托于微纳米加工技术，将电极结构及检测系统微型化，以缩小整个装置的体积，提高传感器的便携性，满足野外或现场检测的需要以及实现植入式体内检测。

（2）集成化

未来的生物检测系统的发展目标是将微流传输系统、传感检测电极、信号处理芯片等部分集成在一起，在实现更强大功能的同时，保证传感系统检测的一致性和相关性，提高传感器的可操作性。

（3）阵列化

利用电极阵列的多个电极可以实现多待测样品或指标的同步检测分析，提高检测效率；也可以对同一指标实现多点测量，通过对检测信号的综合处理提高检测的准确性。

（4）痕量检测

在临床疾病检测及环境监测中，很多样品中待测物的含量非常低，因此需要实现对样品中低浓度物质的高灵敏度检测，实现更理想的检测下限，即痕量检测。

（5）低成本

如果希望免疫电极能够反复使用，需要对传感器电极进行维护和更新，但是电极的维护和更新难度较大，效果不甚理想；特别是应用于如临床医学检测时，考虑到待测物通常有一定的致病性和传染性，电极更是不宜反复使用。因此，研究低成本的安培型生物传感器，实现一次性使用的可抛型检测电极，既提高了使用的安全性，又有利于推广安培型生物传感器的应用范围。

来源： IVD分享库