技术｜一文读懂侧向层析测定（LFAs）

侧向层析测定（LFAs）是在生物医学、农业、食品和环境科学中流行的低成本、简单、快速和便携检测设备背后的技术。

本文概述了该方法的原理和检测的关键组成部分，重点介绍了侧向层析免疫测定。这种类型的测定最近引起了相当大的兴趣，因为它有可能直接为病人提供即时诊断。我们还将讨论结果的范围和解释以及用于评估测定的参数，总结LFA的主要优点和缺点，并提出未来对测试设备和策略的相关改进。

最后，我们将探讨LFA领域的主要最新进展和未来的诊断应用。

1、简介

侧向层析测定（LFA）是一个基于纸张的平台，用于检测和量化复杂混合物中的分析物，将样品放在测试设备上，5 ~ 30分钟内显示结果。

LFA的低开发成本和易生产性使其应用扩展到需要快速测试的多个领域。基于LFA的测试被广泛用于医院、医生办公室和临床实验室，用于定性和定量检测特定的抗原[1]和抗体[2]，以及基因扩增的产物[3,4]。

各种生物样本都可以用LFAs进行测试，包括尿液[5]、唾液[6]、汗液[7,8]、血清[9]、血浆[10]、全血[10,11]和其他液体。进一步采用基于LFA测试的行业包括兽医[12]、质量控制[13]、食品生产中的产品安全[14]以及环境健康和安全[15]。

在这些领域的利用中，快速测试被用来筛选动物疾病[16]、病原体[17,18]、化学品[19]、毒素[20]和水污染物[21,22]等。

近年来，对具有多条测试线的POC多重诊断测定的需求越来越大，允许快速和同时检测样品中存在的多种分析物。

这种测定（可能是单一LFA）应该很容易进行，不需要使用实验室调查，也不需要经过检验分析培训的个人。LFAs是非常好的候选者，因为它们生产成本低，易于使用，重要的是被用户和监管机构广泛接受。

由于开发新技术并将其引入临床诊断市场的途径需要数亿美元和数十年的工作，改进和进一步开发已经建立的LFA技术是一个有利的选择。这一过程有可能生产出可能成为新的挑战性应用（如早期癌症检测）的强大工具的设备。

此外，由于保质期长，而且储存时不需要制冷，LFA非常适用于发展中国家、小型流动医疗机构、偏远地区和战场。

根据所使用的识别要素，LFA可分为不同类型（图1）。本文侧重于‘侧向层析免疫测定’（LFIAs），其中完全使用抗体作为识别元素。核酸LFA用于检测聚合酶链反应（PCR）期间可能形成的扩增子[23]。

图1 | 侧向层析测定的分类

根据测定中涉及的识别元素，我们可以将侧向层析免疫测定（LFIA）和核酸侧向层析测定（NALFA）进行区分。

2、侧向层析免疫测定的原理

LFA的原理很简单：含有相关分析物的液体样品（或其提取物）在没有外力的帮助下（毛细管作用）通过不同区域的聚合物试纸，这些试纸上附着了能与分析物相互作用的分子。

一个典型的侧向层析测试条（如图2所示）由重叠的膜组成，这些膜被安装在一个背板上，以获得更好的稳定性和处理。

图2 | 侧向层析免疫测定测试试纸的典型结构

LFA通常由以下元素组成：样品垫、结合物释放垫、固定抗体的膜和吸附垫。试纸条的各个部分通常固定在一个惰性的背衬材料上。

如图3所示，样品在试纸条的一端涂在吸附性样品垫上，吸附性样品垫上浸有缓冲盐和表面活性剂，使样品适合与检测系统相互作用。样品垫确保存在于样品中的分析物能够与共轭物的捕获试剂和膜上结合。

图3 | 侧向层析免疫测定的操作

（A）测定机制的示意图。顶部：样品沉积在样品垫上并向共轭物迁移。中部：结合的抗体与目标分析物结合，（底部）迁移到测试线，在那里结合的目标分析物被捕获。

（B）最常用的LFA是妊娠试验（hCG一步法尿液测试），它使用hCG试纸。该测试的可能结果和解释见图。如果是弱阳性结果，建议在1周后重复测试。

经过处理的样品通过共轭物释放垫迁移，共轭物释放垫包含对目标分析物有特异性的抗体，并与彩色或荧光颗粒共轭，最常见的是胶体金和乳胶微球。样品和与目标分析物结合的共轭抗体一起，沿着条带迁移到检测区。

这是一个多孔的膜（通常由硝化纤维组成），其上固定着特定的生物成分（主要是抗体或抗原）。它们的作用是与结合在共轭抗体上的分析物反应。对样品分析物的识别导致在测试线上出现适当的反应，而在控制线上的反应表明有适当的液体流过试纸条。

由不同强度的线条所代表的读出结果可以通过眼睛或使用专门的读数器来评估。为了在相同的条件下同时测试多个分析物，可以将针对不同分析物的特异性抗体的额外测试线固定在一个阵列格式中[24,25]。

另一方面，加载同一抗体的多个测试线可用于半定量测定。这种‘梯度条’测定的原理是基于固定化的抗体在每个连续的线上逐步捕获比色的结合物-抗原复合物，在条上出现的线的数量与分析物的浓度成正比[26-28]。

由于条带材料的毛细力，液体流过设备，为了保持这种运动，在条带的末端有一个吸收垫。吸收垫的作用是吸走多余的试剂并防止液体倒流。

LFIA有两种形式：直接法和竞争法。

直接法测试用于较大的分析物，如人类免疫缺陷病毒（HIV）测试中使用的p24抗原（[30]），以及具有多个抗原位点的分析物，如妊娠测试中使用的人绒毛膜促性腺激素（hCG）[31]。

hCG测试是基于夹心法测定的一个例子，目标被固定在两个互补的抗体之间。在直接测试中，测试线的出现表明结果为阳性，质控线通常包含物种特异性的抗免疫球蛋白抗体，对特定结合物中的抗体具有特异性。

如果是具有单一抗原决定因素的小分子，不能同时与两种抗体结合，则采用竞争性试验。在这种类型的测试中，分析物会阻断测试线上的抗体的结合位点，阻止它们与彩色结合物的相互作用。因此，阳性结果由测试线缺乏信号表示，而质控线应独立于测试结果可见。

3、测定方法的组成部分

LFA设备生产中最常见的困难是由设备隐藏的复杂性引起的。由于该试验是由许多元素组成的，问题可能是由材料的兼容性、过度碾压造成的连接缺陷或不完善的材料特性引起的。

在LFIAs的开发过程中，大部分注意力都集中在寻找最合适的检测方法或选择最好的抗原或抗体。然而，为了生产出稳定和高质量的产品，关注测试的所有元素是非常重要的，包括基本组件，如底卡、胶条和覆盖带。

3.1、抗体

尽管试纸条的物理成分、构建技术和缓冲剂在优化测试中起着主要作用，但这些过程的核心是抗体，需要精心设计和高度纯化。确保具有证明的亲和力和特异性稳定的抗体供应是非常重要的。使用单克隆抗体（大多来自于小鼠杂交瘤）是最好的，因为它可以大量生产特异性抗体。

3.2、标签

对纳米粒子标签最重要的要求包括：

➤ 在各种条件和温度下溶液中的胶体稳定性；

➤ 在一个大的（和有用的）动态范围内的检测灵敏度；

➤ 共轭的效率和可重复性（不损失化学和生物的完整性和活性）；

➤ 缺乏或非常低的非特异性结合特性（确保高信噪比）；

➤ 以低廉的成本实现商业化；

➤ 容易和可扩展的共轭程序。

如今，胶体金是商业化LFIA中最广泛使用的标签。尽管它可以在实验室中以低成本制备，但有许多商业来源可供选择。它具有强烈的颜色，而且不需要显影过程就可以看到。此外，它在液体和干燥状态下都有很高的稳定性。

另一个流行的标签是乳胶，它可以用各种检测试剂标记，如彩色或荧光染料，以及磁性或顺磁性成分。由于乳胶可以生产出多种颜色，它可以应用于多重测定，这就需要在众多线路之间进行区分。

碳和荧光标签，或对标签进行酶促修饰[32,33]，也被用来提高测定的灵敏度。碳纳米管已被证明具有比金低10倍的检测极限[34]。

荧光纳米粒子，如量子点，可能会导致高背景噪音，这已被证明可以通过聚合物封装和表面阻隔来克服[35]。

3.3、膜

膜被认为是LFA试剂条中最关键的元素，到目前为止，硝酸纤维素是最常用的材料。

此外，还有用于脱氧核糖核酸（DNA）杂交检测的‘柱状’毛细管LFA装置（其中微柱阵列代替了膜），其优点是可以更精确地控制毛细管流[36]。

表征好的膜材料重要参数是毛细管力，以及后续选择、反应和检测所需的蛋白质容易结合和固定。有一系列硝化纤维素的孔径可供选择，从0.05到12 μm。

然而，由于孔的分布不均（由于制造过程），毛细管流动时间是一个更准确的参数，在选择最有效的条带材料时应使用它。毛细管流动时间是液体到达并完全充满膜条所需的时间。

3.4、样品垫

样品垫可以有多种作用，其中最重要的是均匀分布样品并将其引导到共轭垫上。样品垫通常浸渍有缓冲盐、蛋白质、表面活性剂和其他液体，以控制样品的流速，并使其适合与检测系统的互动。此外，样品垫的孔隙可以作为过滤器，以去除多余的物质，如红细胞（图4）。

图4 | 一个与试纸盒和试纸条阅读器相结合的综合样品采集装置示例

该装置是为方便收集全血样本和运行定量测试而设计的。红细胞在样品垫上被机械地分离。

3.5、共轭垫

共轭垫的主要作用是容纳检测器颗粒，使其在功能上保持稳定，直到进行测试。这是由含有碳水化合物（如蔗糖）的共轭缓冲液的组成来保证的，碳水化合物可作为防腐剂和溶解剂。当共轭物颗粒在糖的存在下被干燥时，糖分子在其周围形成一层，稳定其生物结构[37]。

当样品进入共轭垫时，糖分子迅速溶解，携带颗粒进入液体流。各个试纸条之间的释放是一致的，这一点至关重要。

3.6、吸收垫

吸收垫的作用是将液体吸过膜并收集处理后的液体。吸收垫允许使用更大的样品量，从而提高测试灵敏度。最受欢迎的吸收垫是由纤维素过滤器制成的。

4、检测方法

由于LFIA是一种基于抗体的技术，特异性和灵敏度可能会受到具有类似结构的其他化学品的影响，导致假阳性结果。测定的灵敏度受到抗体-抗原结合物的Kd（解离常数）和比色法的限制。

为了克服这些限制，已经开发了读数和新型生化技术，以提高产品质量和客户的便利性。检测系统的选择主要由分析中采用的标签决定。荧光染料或顺磁颗粒不能用肉眼直接检测，需要专用的阅读器进行定量分析（表1）。

表1 | 侧向层析测定中最常用的检测方法

这些系统的应用实例可以在光学读取器[45,46]、摄像读取器[47]、梯度条[26]、荧光读取器[48]、化学发光读取器[49]和电化学读取器[50]中找到。标签的例子包括：荧光[51,52]、顺磁[47,53]、酶[54,55]和碳纳米粒子[34]。

此外，自动检测方法在时间消耗、结果解释和变量调整方面比人工成像和处理有优势。

5、LFAs的优势和劣势

许多LFIAs是为在POC/需求点使用而设计的，提供了许多行业所需的廉价、快速和简便的测试。然而，监管机构往往要求使用独立的方法确认结果。因此，LFIA只适用于在POC/需求点进行初级筛选。

由于它们的保质期较长，而且储存时不需要冷藏，这些测试非常适用于发展中国家的使用。由于视觉结果通常是清晰的，容易区分的，所以不需要额外的特定设备。表2列出了LFAs的优点和缺点的摘要。

表2 | 侧向层析测定的优势和劣势

研究将解决LFAs的一些关键弱点，特别是在定量结果方面。数据可以使用扫描仪或照相机和专用软件进行数字化，这也将允许记录结果。然而，技术改进将影响仪器的成本和分析的时间。

6、LFAs的新策略

近年来，LFA发展的主要进展包括新的信号放大策略、新标签的应用、改进的定量系统和同步检测。一些用于增强胶体金纳米粒子（GNPs）信号的新策略采用了银增强技术[38,39]或将GNPs与一种酶（如辣根过氧化物酶）结合起来，从而导致信号的催化放大[33]。

为了提高检测灵敏度，已经开发了新的试剂，包括磁性颗粒，如纳米金微球，或免疫纳米颗粒，它们将检测极限降低到至少0.1ng/ml[40]。

另一种提高测定灵敏度的方法是实施合适的数量系统，如热对比、激光或发光二极管（LED），这可以使信号放大到1000倍[41]。

一些同步检测技术的成功发展已被描述，其中包括胶体金纳米粒子和寡核苷酸的组合，用于同时检测抗原和抗体[42]，以及使用两个共轭垫来同时检测两种蛋白质[43]。

此外，LFA与计算方法的结合导致了第一个与电子逻辑门如‘OR’和‘AND’结合的例子，提供了一个新的逻辑感应平台[44]。

7、讨论

为了满足下一代诊断市场所要求的标准，LFAs的一些基本特征必须得到改进。

首先，测定需要更多的重复性和灵敏度，更容易制造和操作，最重要的是从临床角度来看，它们应该提供与其他实验室诊断系统相关的结果。为实现这些目标，需要实现制造过程和样品应用的自动化，以及改进读出和数据处理。

此外，应该应用材料科学，使新的更合适的定制设计的材料投入使用，以及引进新的标签和阅读技术。

使用新的标签，如量子点和上转换荧光粉（将红外光波长转换为可见色光的微型陶瓷粉末）将提高灵敏度，允许使用分析物浓度较低的样品，如汗液或丹参。

在发达国家，将LFA整合到片上实验室设计中可能会带来额外的优势，但也会增加成本。对于非实验室的应用，LFA应该保持简单和可负担得起；然而，必须有良好的识别元素，而且必须有足够的视觉定性（开/关）或半定量的结果。

8、结论

LFA独特而显著的特性为医学、农业、食品和环境安全领域的疾病生物标志物和感染性病原体的检测做出了贡献。尽管该方法的原理几十年来一直没有改变，但LFA技术一直在不断改进，从而提高了灵敏度和重现性，并能同时检测多种分析物。

重要的是，这些测定现在可以在实验室外有效地进行，为在发展中国家和护理点使用提供了巨大的优势，无论是在野外还是在更传统的临床环境中。

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