反转录后的定量聚合酶链式反应分析，或称qRT-PCR，是一种极其敏感的、具有成本效益的方法，用于量化植物细胞的基因转录物。

非特异性双链DNA（dsDNA）结合荧光剂（如SYBR Green）和384孔板实时PCR仪（可在每个PCR周期结束时测量荧光）的出现，使得对数百个基因或处理并行进行qRT-PCR成为可能。这促进了对大型基因家族所有成员的比较分析，如转录因子基因[1]。

鉴于PCR试剂的成本相对较低，以及qRT-PCR的精确性、敏感性、灵活性和可扩展性，难怪全世界数以千计的研究实验室已将其作为测量转录物水平的首选方法。

然而，尽管它很受欢迎，我们仍然看到qRT-PCR分析方法的应用存在系统性错误，这可能会影响到结果的解释。本文强调了许多常见的错误来源之一，即在对不同的生物样本进行比较分析之前，不适当地选择参考基因来规范测试基因的转录水平。

以下是qRT-PCR的11条黄金规则，如果遵守这些规则，应确保植物和其他细胞中转录物丰度的可重复性和准确性。

这些规则是使用两步RT-PCR（其中一个RT反应的产物被用作多个PCR反应的模板）对RNA进行相对定量，用SYBR Green检测基因特异性PCR产物，以及在比较样品之前用参考基因对测试基因的转录物水平进行标准化。

进一步的细节可以在其他地方找到[1,2]。这些规则中的大部分也适用于采用序列特异性荧光探针的相对定量方法，如TaqMan探针，以及绝对定量方法。

1)   从至少三个生物重复中收获材料，以便于数据的统计分析，立即在液氮中冷冻，并储存在-80℃以保存全长的RNA。

2)   使用RNA分离程序，从所有要分析的样品中产生高质量的总RNA。使用Agilent 2100生物分析仪（RNA完整性编号，RIN > 7，最好 > 9）或通过在高分辨率琼脂糖凝胶上的电泳分离（寻找清晰的溴化乙锭染色的rRNA条带）和分光光度法（A260/A280 > 1.8和A260/A230 > 2.0）检查RNA质量。使用A260值对RNA进行定量。

3)   用DNase I消化纯化的RNA，以去除污染的基因组DNA，因为它可以在PCR过程中作为模板，导致虚假的结果。随后，使用基因特异性引物对经过处理的RNA进行PCR，以确认没有基因组DNA。

4)  用无RNaseH活性的强效逆转录酶（如Invitrogen公司的SuperScriptIII或Ambion公司的ArrayScript）进行RT反应，以使cDNA长度和产量最大化。只有在所有实验中使用相同的引物策略和反应条件，并且反应中含有相同的RNA总量时，qRT-PCR基因表达测量才具有可比性[5]。

5)   测试cDNA的产量和质量。对每个样品的cDNA等分进行qPCR，使用一个或多个已知在实验条件范围内的器官/组织中稳定表达的参考基因的引物。所有样品中每个参考基因的阈值周期（Ct）应在平均值±1范围内，以确保每个RT反应的cDNA产量相似。cDNA的质量可以用两对相距1 kb的参考基因的引物来评估。通常，cDNA 5′端的引物对的Ct值将高于3′端的引物对的Ct值，因为逆转录从模板mRNA的3′[poly(A)]端开始，并不总是延伸到模板的5′端。理想情况下，5′端引物对的Ct值不应该超过3′端引物对的Ct值一个周期数以上。

6)   使用一套标准的设计要求（如引物Tm = 60 ± 1℃，长度18至25个碱基，GC含量在40至60%之间）设计基因特异性PCR引物，在初步测试中从复杂的cDNA样品中产生预期长度和序列的独特的短PCR产物（60至150 bp之间），以方便使用标准PCR程序进行多平行的qPCR。3′-非翻译区是引物设计的良好目标，因为它一般比编码序列更独特，而且更接近RT起始位点。

7)   通过标准化（如果可能的话采用自动化）和尽量减少移液步骤来减少PCR反应设置中的技术错误。将cDNA与qPCR试剂混合，然后将此“主混合物”的标准体积等分到含有特定引物的标准体积的每个反应孔中。在无尘的清洁环境中建立反应，最好是在正向气流罩中。通过对无模板（水）对照进行PCR反应，常规检查引物和试剂库存的DNA污染情况。

8)   对于转录物水平的相对定量，设计和测试至少四个潜在的参考基因的基因特异性引物，这些基因是从文献[2]或自己的经验中选择的，可能在所有要比较的器官和处理中稳定地表达。在初步实验中对你希望比较的组织和处理范围的参考基因进行验证，在RT-PCR之前，在每个RNA样品中加入一个外来的cRNA，以便在评估参考基因的表达稳定性之前，使参考基因的转录物数据正常化[2]。

9)   对每个样品平行进行测试基因和参考基因的实时PCR，在每个扩增周期后捕捉dsDNA的荧光数据。同时，在PCR运行结束时进行dsDNA熔解曲线分析。当依靠非特异性DNA结合的荧光剂，如SYBR Green，来量化相对dsDNA的数量时，要确保使用凝胶电泳和PCR扩增子熔解曲线数据，分别只产生一个具有预期长度和熔解温度的PCR扩增子。通常使用热启动Taq聚合酶、SYBR Green和其他试剂的商业混合物，如应用生物系统公司的Power SYBR Green Master Mix，并观察到不同供应商的此类产品的功效（PCR效率、特异性和/或产量）存在明显差异。

10)   确定哪种参考基因最适合于所有样品中测试基因转录物水平的正常化（例如，使用geNorm[6]或BestKeeper软件[3]），它不仅使用Ct值作为输入，而且还使用每个反应的PCR效率。PCR效率可以通过LinRegPCR程序[4]从扩增图中方便地得出。通过经典的校准稀释曲线和斜率计算进行估计也是可能的，尽管比较复杂。

11)   最后，使用一个公式计算每个样品中每个基因的相对转录物丰度，该公式结合了测试基因的PCR效率以及测试基因和参考基因的Ct值。

来源： 诊断科学