最佳的引物和探针设计是开发可靠PCR的最关键步骤之一。最初，设计是手工进行的。目前，使用的是基于网络的免费软件或商业化的软件。过去制定的准则仍然适用，但它们被更新为现代的见解，并被纳入目前的工具中。

因此，可以根据各种参数计算出特定目标序列的最佳引物-探针组合。对目标序列的良好特异性是至关重要的，可以用核苷酸BLAST（基本局部比对搜索工具，NCBI网站）来定义。

每个工具都有自己的策略，但与此同时，自由能（DG）总是被用来评估引物、探针和目标物内部和之间所有可能的相互作用。如果相互作用，即碱基配对，是非常可行的，自由能将导致一个负值。

DG值越负，相互作用的风险越高，由于引物二聚体或探针与引物和/或目标物之间的杂交，PCR反应的效率就越低。

多重PCR策略中引物/探针设计的软件包也可以使用，如AlleID®和Beacon Designer™，或免费工具Multiplex 2.1。大多数引物和探针是用Primer3或Primer3Plus设计的，这是互联网上的一个用户友好界面。获得引物/探针序列后，需要通过核苷酸BLAST检查数据库中的唯一性。

互联网上有各种指导性、教育性的文本，例如，成功的qPCR实验的步骤，讨论引物设计的连续步骤[8]或设计PCR引物和探针，侧重于正确的标准。

2.1、引物/探针序列中的错配对使用（RT）-qPCR进行定量分析的影响

尽管在设计独特的引物时，要求引物与目标物之间完全匹配，但这两者之间的错配可能是目标物本身的固有属性，在某些情况下是不可避免的。因此，重要的是要知道哪些错配是可以预期的，它们对（q）PCR和反应效率的潜在影响是什么。换句话说，要知道哪些错配是可以容忍的（错配容忍度），哪些错配会损害qPCR。

错配耐受性在qPCR设计中是众所周知的，用于检测非100%保守的目标，如（RNA）病毒及其各种亚型（如甲型和乙型肝炎病毒，流感病毒），白血病细胞和携带SNP的目标。

另一方面，引物、探针和目标序列之间的这些错配可以旨在区分人群中的遗传变体（错配识别；即突变、SNP或遗传变体）。此后，将讨论这两种情况。

2.2、错配容忍度

错配容忍度是引物设计的一个问题。在某些情况下，可能无法找到100%的保守区域来设计引物和探针。尽管位置不同，引物和目标序列之间的每一个错配都会导致Tm的降低。取决于所涉及的碱基（AT或GC），引物的Tm可能会降低数度，同时降低旨在完全匹配的循环方案中的qPCR效率。

考虑到陡峭的熔解曲线，只要错配不在引物的3′端，Tm下降几℃仍然可以进行qPCR。例如，如果引物的Tm是72℃，退火温度是62℃，那么引物序列中大约2-3个错位不会影响扩增本身，但动态反应平衡会变差，导致效率降低（引物设计程序可以用来计算Tm相对于目标的降低）。

这种降低的Tm可以接受，不需要额外的措施。然而，有几种改进是可能的。一种是在引物的5′端增加几个匹配的核苷酸，这将提高Tm值；另一种是在错配位置设计带有碱基变体的混合引物。

最后，可以通过增加浓度来推动反应平衡，使之与引物结合，仔细滴定以避免产生不必要的PCR产物。

如前所述，在PCR反应中，引物序列3′端的错配比5′端的错配更难容忍。用十倍稀释系列的校准曲线与许多可能的引物错配进行的模型研究显示了量化参数的明显差异。例如，一个单一的G-A错配（引物序列中的G残基与目标序列中的C残基相对应）对引物的3′端位置有3log10的欠定量影响，只要qPCR能够运行。

如果G-A错配位于第二个位置，将发现大约2log10的定量不足。当第三个位置可以出现1log10的影响时，引物序列的第5位几乎没有任何影响。一些错配也可分为高影响或低影响的错配。

A-C、C-A、T-G和G-T错配几乎没有任何影响，甚至在引物的远3′位也没有影响（定量下的2至4倍）。然而，T-C、C-T和T-T对PCR的效率有很大的影响（在引物的3′端位置上是定量的10至30倍）。A-A、C-C、G-G、G-A和A-G错配确实对PCR效率有最大的影响（在PCR反应中对目标的定量不足100倍以上）。

由于在RNA病毒中观察到的遗传变异性造成了引物设计上的问题，现有的引物集可能会遗漏新的变体。因此，必须定期对照基因组数据库检查引物（核苷酸BLAST），如果有新的基因型公布，而目前的引物又不能检测到，则要对其进行修正。

如果在一步RT-qPCR中使用耐错配的基因特异性引物，同样的错配会损害逆转录酶步骤的效率。不同的反应类型（一步/两步方案）和酶都有自己的技术挑战，特别是当目标的基因变异可以预期时。

检测RNA病毒的分子诊断通常使用MuMLV逆转录酶衍生物在大约48℃下进行一步RT-qPCR反应，特定的qPCR-primers作为RT反应的起点，Taq-DNA聚合酶作为PCR酶。值得注意的是，cDNA的合成是单向的，以RNA链为模板进行。

参考原始的DNA-模板链（如mRNA检测中的情况），RT反应因此只需要相应的反义/反向引物。反向引物中的错配也会影响RT反应的效率。尽管RT反应中较低的退火温度会补偿不严格的匹配，但cDNA合成的效果可能会降低。

然而，即使是反向引物序列远3′端位置的双错配也会被MuMLV以合理的方式延长。在这种低温下，对PCR本身影响最大的3′-C-C错配对逆转录几乎没有任何影响。

虽然在整个反应混合物中存在，但正向引物并不参与cDNA的合成，有义/正向引物中的3'-C-C错配只会与PCR反应本身不相容。当AMV衍生物（RT反应在55℃）用于反转录酶步骤时，反转录更加严格，反转录引物中的错配将对RT-qPCR结果产生更大影响。

其他规则适用于rTtH，一种具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的热稳定DNA聚合酶，可以在60-62℃的单一温度下用于一步RT-qPCR反应。因此，与MuMLV相反，反向引物中的错配对Taq DNA聚合酶的PCR效率有很大影响，也会影响Tth的反转录酶步骤。在这种情况下，（基因）特异性引物的严格规则与引物设计一样适用。

使用随机六聚体启动逆转录酶反应的两步RT-qPCR超越了基因特异性引物的错配问题，但PCR反应本身仍然受到影响。

2.3、错位歧视

错配鉴别意味着（q）PCR反应检测基因变异（如SNP）的能力，并且与诸如识别遗传性疾病或变异的病毒和细菌基因组有关。

用分子诊断法准确确定这些碱基变异是非常重要的。引起感染的病毒或细菌中存在的一个单一突变可能导致抗病毒或抗菌的耐药性，或成为血红蛋白病的原因（如镰状细胞病和ß-地中海贫血）或药物的不同代谢。

传统的Sanger测序是一种相当缓慢的、劳动密集型的和昂贵的方法，此外还相当不敏感。一个突变应该存在于20%以上的人群中，才能达到常规Sanger测序的检测水平。

为了通过PCR检测目标的点突变，错配必须位于引物的远3′端。如前所述，这并不总是可能的，而且分辨力也不总是100%。一般来说，用RFLP或PCR-RFLP检测突变是比较敏感的，但非常耗费人力和时间。因此，这些技术不适合用于诊断目的。

RT-qPCR使用特殊的探针来检测特定的变异。分子信标、MGB/LNA探针和双探针是一般用于检测错配的探针。

分子信标是具有茎环结构的寡核苷酸。当环与同源目标退火时，茎会展开，从而增加报道者和猝灭者之间的距离，停止FRET-猝灭。一个分子信标可以识别一个单碱基突变。

水解探针如果在RT-qPCR的退火阶段与目标杂交，将在延伸阶段被DNA聚合酶的5-3′外切酶活性水解（见图3.23）。一般来说，对于正常水解探针的长度来说，需要三个突变来区分错配。

Minor Groove Binding（MGB）探针是带有3′-prime bond二氢环吡咯三肽的水解探针。这将增加探针与目标DNA螺旋结构的小沟的亲和力，允许减少探针的长度。因此，突变的影响比正常长度的水解探针要大得多，它可以将鉴别力提高到小于3个突变的程度。锁定核酸（LNA）探针也有这个原理。

LNA是RNA，其核糖部分的2′-O和4′-C相互连接，改变构象。LNA的特定定位将增加探针的亲和力，因此，LNA探针可以比正常的水解探针短得多。与MGB探针一样，突变对探针的亲和力有很大影响。

MGB和LNA探针可被设计用于RT-qPCR，以识别仅存在于1-5%人群中的变异体，其灵敏度与正常水解探针检测相同（取决于程序，最高可达20-500拷贝/mL）。

双探针被设计用来检测目标物中间的一个单碱基错配。两个探针串联杂交，而下游的探针在3′端有一个野生型或错配的碱基。

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来源： 诊断科学