引物和探针的核苷酸序列至关重要，因为目标识别和后续步骤是通过杂交过程启动的。引物总是用化学方法合成的，长度在6个（随机六聚体）和大约100个碱基（用于PCR的复合引物）之间。

平均而言，引物的长度为19~25个核苷酸。引物可以在每个需要的位置上进行标记，例如用荧光素或生物素。另外，长度相当的探针，无论是否标记，都可以用化学方法合成。

除此之外，探针还可以通过分子生物学技术生产，如克隆或通过PCR扩增的方式。探针的大小可以有很大不同，而诊断（或研究）问题的定义决定了哪种探针最适合（图1）。

图1 | 杂交和检测杂交探针的命名法

一些表型的示意性概述：

➤   寡头探针，在化学合成过程中进行标记，通常用于不同的独特探针的混合；

➤   片段探针，通过重组DNA技术或PCR检测产生，通过酶技术进行末端标记；

➤   总探针，通过重组DNA技术生产，通过随机引物或切口平移标记。

另外，选择的标签也是由问题决定的。稳定性，即引物或探针与目标之间的相互作用强度，可以通过应用5′-MGB（小沟结合）（图2）或加入锁定核酸（LNA）或蛋白核酸（PNA）来加强。也可以在PCR混合物中加入各种物质，以加强或削弱探针与目标的相互作用强度。

图2 | 小沟结合（MGB）

a MGB是一种二氢环吡咯三肽，对DNA分子的小沟有特殊的亲和力。它增强了引物或探针的杂交能力。这样，只使用了普通数量的核苷酸的一半。

b中概述了传统探针和MGB探针的杂交和随后的融化过程。目标的大小是27bp，5′端第5位有错配（绿色野生型，蓝色T/C错配）。很明显，与传统探针相比，短的MGB探针具有更高的区分突变体和野生型的能力。

引物在诊断学中主要用于扩增技术、cDNA合成、第二代测序和某些微阵列技术。只有PCR使用引物对组合，即两个可以在目标上下游退火的引物。这样，合成的核酸的大小就被确定了。可以使用以下引物的变体：

➤  独特的引物使用独特的序列识别某个目标，在基因组或基因表达产物的其他位点上没有出现过。独特引物可用于PCR、测序和cDNA合成。独特引物可分为两类；完全匹配的引物和不匹配到一定程度的引物。后者可以专门设计，例如区分野生型和突变型基因组（错配鉴别）或能够检测一个（亚）物种或更高层次如家族的基因型中出现的一个或多个SNPs（错配耐受）。由于SNPs可以在复制过程中从新形成，特定的引物会失去其独特性。3′末端或附近的错配将在PCR中产生假阴性。

➤  非唯一引物可用于各种类型。重复引物粘附在多个位点上。突出的目标序列是微卫星，如（CACA）n-repeat、UTR或RE位点。Oligo-dT-引物用于真核生物的cDNA合成。这些引物与真核生物mRNA的3′-聚A-序列杂交。随机六聚体是用于cDNA合成、「缺口」翻译和微阵列的比较基因组杂交的通用引物。

➤  特殊引物，主要是独特引物的变体，在设计独特的引物时，世界范围内可用的数据库，主要是GenBank，和搜索工具（例如BLAST-基本局部比对搜索工具）是必不可少的资源。现在，越来越多的物种、基因型、甚至个体基因组的完整序列都是已知的。

对于开发新的诊断性PCR，诊断问题的定义是至关重要的：

➤   需要识别哪个目标？

➤   目标是一个基因、一个非编码片段、一个特定的突变甚至是一个易位？

➤   是想识别一个病原体、一个抗性基因还是一组相关病毒的毒力因子？

➤   是否需要确定一个肿瘤的表型或基因型或一个偏离的甲基化？

对于所有这些目标，重要的是至少要知道独特引物退火点的序列。随后，重要的是了解目标的性质，包括开放阅读框架（ORFs）的存在、组成（GC含量、保守片段的存在（有少量碱基变化）、二级结构和限制位点）、遗传（进化）稳定性，以及与突出序列的同源性，最好是BLAST控制。

随后，可以使用特定的（免费）（基于网络的）软件工具选择引物。更复杂的软件工具可在市场上买到，一般来说，不基于网络。

独特的引物需要根据一些标准来设计，这些标准涉及引物的统一性、杂交条件下的线性、与目标物杂交时的稳定性、减少合成非特异性产物的变化等。许多这些标准被纳入独立的或在线的软件中；当引物不理想时给予惩罚，或对最佳引物给予高分。在此，以下要求是非常重要的：

➤  引物内没有碱基配对（引物在杂交过程中是「开放卷曲」的）。

➤  没有GC-, GG-或CC-重复。

➤  应避免有超过3个相同碱基的重复（同聚物运行）。

➤  与3′端部的目标完美匹配。

➤  一个最佳的引物序列包含分布良好的核苷酸；即在位置和类型上都是如此。

➤  应防止正向引物和反向引物之间因互补碱基而杂交形成双联，特别是不应该有3′互补（图3a）。DNA聚合酶将产生引物二聚体，也被称为自体二聚体或交叉二聚体，从两个引物甚至小的双联区的3′-OH末端开始。即使没有3′-互补性，在反应物的不利比例下，如没有目标，也可能形成二聚体（图3b）。由于引物内其他核苷酸位置的互补性，引物之间的碱基配对也必须避免，因为这也可能导致引物二聚体的尺寸较小，熔化温度较低。虽然引物二聚体很容易被识别，但特异性扩增的效率会降低。

➤  Tm值需要相似；最好在60℃左右，不低于56℃。

➤  引物的GC含量最好保持在45%以下，但应与完整的目标序列保持一致。

➤  优选的是，引物序列由分布广泛的核苷酸组成，并避免同聚物的运行。

➤  目标的引物退火位点必须是可接触的，最好不要位于稳定的发夹内。

➤  引物序列的理想长度为18-25个核苷酸，与所需的Tm和特异性有关。当使用LNA核苷酸或MGB时，要求的长度可能短至12个核苷酸。

➤  对于某些DNA，有可能设计出与两个连续外显子退火的引物，以防止与含有内含子序列的基因组DNA杂交。在这种策略中，基于内含子序列的引物设计是检测基因组目标的一种选择。然而，对假基因的鉴别是不可能的。由于许多细菌和线粒体DNA缺乏内含子，因此不可能设计出跨越内含子的引物。

➤  一对引物必须对其互补的目标序列有相当的亲和力（即Tm）。这将促进聚合过程中生长的新DNA链的稳定性。

➤  当测试样品含有目标DNA时，设计的引物需要产生正确长度的扩增物，而在非目标DNA样品中，不应该形成扩增物。

➤  探针检测中使用的引物对的Tm需要与探针的Tm一致，例如水解探针要低5-10℃（见第3.6.1节）。

➤  离子强度（Na+；Mg2+）、缓冲液（容量）、寡聚物的浓度以及如果有的话，PCR混合物中的DMSO必须作为新引物设计的参数。

如果在某些位置可能出现错配，可以将错配容忍度作为引物设计的标准。

图3 | 3′-互补性

a 一对引物的3′互补性导致两个引物的3′端相互杂交时合成引物二聚体。1987年在使用PCR检测镰状细胞贫血症的引物中首次描述了这种假象。

b 没有3个互补的引物二聚体可能是由于产品的不良比例造成的，如引物过多，特别是在没有目标的情况下（如目标的拷贝数很低或在阴性对照中）。引物二聚体（大小为30-50bp）可通过琼脂糖凝胶电泳（b；左）或熔解曲线分析（b；右）来观察（二聚体在70℃下熔解，扩增物在更高的温度下熔解）。

一般来说，引物被设计成与目标序列上的互补碱基完全杂交。第3.5节讨论了这一规则的例外情况。

探针需要与一个互补的目标序列进行唯一的杂交。探针所针对的序列取决于（诊断）问题。例如，需要检测的是什么？为什么？检测的结果意味着什么？是基因组DNA、mRNA或rRNA还是具有诊断作用的miRNA之一？探针的大小和类型以及相应的杂交方法都存在很大的差异。

每种变体都是可能的；双链和单链的DNA或RNA探针，可以与DNA或RNA杂交。这意味着DNA:DNA、DNA:RNA或RNA。RNA的组合可能发生。根据GC比率的不同，形成稳定的杂交体所需的最小长度是13-20个核苷酸。理论上，没有设定最大长度；有时，大于400个碱基的探针会被分解（图1）。

一般来说，反应条件要根据每个特定的探针-目标组合以及反应发生的基质来调整。需要在大小、核苷酸序列和目标物浓度，以及产生足够信号所需的探针量之间取得平衡。

探针的杂交能力描述了探针与目标结合的能量。简而言之，两个互补的（多/寡）核苷酸链内和之间的所有非共价相互作用的总和表示为ΔG（吉布斯自由能），单位为kcal/mol。这个数值越负，探针与目标的结合就越强。

正值表示需要添加能量，不会自发发生反应。促进探针杂交能力的因素是探针的G/C含量和大小。富含A/T的寡头探针将更容易从其目标上解离。最好是探针的G/C含量与目标序列周围的区域相似，特别是在基于探针的PCR中。

如前所述，对探针的最大长度没有限制。在分子诊断中，探针用于鉴定原始或纯化的样品、细胞或组织样品中的目标DNA，无论是否在扩增目标（s）之后。用于PCR的探针的正常长度约为15-30bp。

如果在PCR反应中使用，这些探针通过杂交确认扩增物的存在。特别是，实时PCR的引入导致了水解探针、「双」探针和分子信标的大规模使用，成为确认扩增物身份的重要工具。这尤其适用于微生物学和突变检测研究。

适用于筛选DNA数据库和染色体分析的探针可能有数千个核苷酸长。几乎在所有情况下，碱基序列都需要知道。然而，「全染色体」杂交、SNP阵列或比较染色体杂交（CGH）则不需要。当序列已知时，探针的设计与引物的设计是相同的。

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