（3）连接分子。连接分子是连接特异抗体与DNA之间的分子。目前介绍的方法中均是通过生物素与亲和素系统使特异抗体与DNA连接，生物素和亲和素作为免疫PCR的连接分子在连接方式上有许多差异。Sano首次报道PCR时用的是重组葡萄球菌A蛋白-亲和素嵌合蛋白(SPA-亲和素)。其具有结合IgG和生物素的两个位点，因此可以将IgG与生物素化的DNA连接成复合物。由于重组的SPA-亲和素没有商品试剂，且SPA不但可以结合特异抗体的IgG，而且还可以与样品中吸附于固相的无关IgG结合，特别是检测的抗原就是某种IgG，因此，Ruzicka认为Sano的免疫PCR本底高且特异性差。

Ruzicke用商品化的亲和素系统试剂建立了一种免疫PCR，这种方法是先将亲和素与生物素化的DNA预结合成复合物，然后再与结合固相的特异性抗体结合，这种方法存在的问题是亲和素与生物素化的DNA分子预结合时二者的分子比例并不是等同的，一个亲和素分子可以结合4个分子生物素，因此，在预结合时生物素化的DNA分子不能过多，否则DNA分子上的生物素将亲和素完全饱和，亲和素再无结合生物素化抗体的能力；但在低饱和生物素化DNA时，亲和素结合的生物素化DNA存在许多种类的复合物，甚至还有游离的亲和素，只有部分结合生物素化DNA的亲和素才能起到连接分子的作用，因此，这样预结合的亲和素和生物素化DNA是一均质性很差的混合物。虽然预结合的复合物可以减少测试过程中的1次孵育和冲洗，但是这样的复合物作为连接分子必然导致敏感性低和误差大，并且每次制备的连接分子均有差异，从而导致重复性差。

Hong zhou等建立了一种免疫PCR方法，连接分子是链霉亲和素，在连接抗体和DNA时是以游离的方式加入，这样链霉亲和素先与生物素化抗体结合，冲洗后再加入生物素化的DNA。这个方法虽然多了1次孵育和冲洗过程，但具有较好的敏感性和重复性。

（4）生物素化DNA。免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶将结合于固相上的DNA特异放大，由此定量检测抗原。

免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是应用了PCR强大的扩增能力。免疫PCR中的DNA分子可以选择任何DNA，但要保证DNA的纯度，且有较好的均质性，应尽可能不选用受检样品中可能存在的DNA。一般可选用质粒DNA或PCR产物等。

DNA的生物素化是用生物素标记的dATP或dUTP通过DNA聚合酶标记在DNA分子上，一般是1个分子DNA标记2个生物素，标记率可达100%。生物素化的DNA用量需预先选定，过多易出现非特异结合而引起本底过高，过低将导致敏感性低和出现不同浓度抗原得出同样结果的饱和现象。

（5）PCR扩增系统。免疫PCR的PCR扩增系统与一般PCR一样，主要包括引物、缓冲液和耐热DNA聚合酶。由于免疫PCR需用固相进行抗原抗体反应，同时又需要对固相结合的DNA进行扩增，因此，免疫PCR固相的选择应根据具体情况确定。用微量板作为周相必须有配套的PCR仪，以便可以用微量板直接扩增，否则需要用PCR反应管作为固相。

扩增后的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。根据产物的大小选择两种凝胶的浓度，电泳后凝胶经染色和拍照记录结果，再检测底片上PCR产物的光密度，并与标准品比较就可以得出待检抗原量。

免疫PCR最成功的平台是由Chimera Biotec GmbH（德国多特蒙德的生物技术公司）开发的IMPERACER平台。Chimera Biotec GmbH总部位于德国，其主要开发和销售超敏蛋白检测平台，具有三大生物分析检测平台：ELISA、IMPERACER和SIMOA，三种技术平台有其各自优缺点。其中IMPERACER就是采用的immuno-PCR技术。

IMPERACER将抗体偶联DNA作为检测试剂，通过real-time qPCR扩增来确定检测结果。和传统ELISA相比，具有以下几点优势：灵敏度高1000倍，检测范围达到五个数量级，基质背景低，需要样本量少。