大家好，在之前的文章当中，我们讨论了「芯片实验室」的设计和开发相关的问题，在这篇文章当中，我们来谈一谈它的应用。

小型化微流控平台的一个关键优势是能够以可靠的方式进行「现场」分析。例如，设备可被设计用于被认为存在可疑病原体或毒素的环境中，并采用基于抗体的检测策略。

在这里，分析样品（例如用于毒素分析的水或用于病原体检测的食品样品）可以在「源头」采集并直接用便携式平台检测。这种设备体积小，很容易实现。

病原体在自然界中无处不在，除了严重损害供人类消费的农产品的质量外，还对人类和动物宿主的福祉构成了相当大的风险。因此，当务之急是以快速、敏感和特异的方式检测细菌和真菌病原体及相关毒素。

迄今为止，这些检测方法大多集中在检测人类病原体大肠杆菌O157：H7。这种肠道传染病的革兰氏阴性杆菌是食源性疾病的致病菌，有可能是致命的。

传播通常通过粪口途径进行，感染的症状包括腹泻和恶心。

检测这种菌株的「芯片实验室」免疫检测早期例子，是使用PDMS作为微流体基质。

与选择完整细胞作为待测物的检测方法不同，细胞被收获和裂解以释放内部抗原决定因素，这种策略通常在有蛋白酶抑制剂的情况下进行，以确保表位结构构象被保留。

我们选择了一种与生物素结合的leporine宿主多克隆抗体，通过使用与共振光散射（RLS）金纳米粒子（80纳米）结合的山羊抗生物素检测抗体来提高检测灵敏度，这有利于通过电子显微镜进行观察。

使用这种颗粒的好处是，它们允许入射白光的散射产生单色白光，这可以通过暗视野显微镜观察到。作者随后能够通过数码相机和暗场变焦立体镜对PDMS微通道进行成像，定制开发的计算软件用于监测结合事件产生的颜色变化。

上述组件的整合导致开发出一种敏感的大肠杆菌O157:H7抗原检测方法，在样品浓度为6至600 ng/μL时即可检测到。

该检测平台还能够检测幽门螺旋杆菌，一种革兰氏阴性的嗜微细菌，它是人类宿主慢性胃炎的致病因素，其水平与传统ELISA提供的水平相似。

另外，一中基于免疫磁性检测的手持便携式大肠杆菌O157:H7检测平台也被开发了出来。与之前使用PDMS的例子不同，该平台优先选择氮化硅（Si3N4）而不是SU-8和二氧化硅（SiO2）作为直接固定抗体的基材，并使用完整的细菌细胞进行检测。

夹心试验的形式包括一个辣根过氧化物酶（HRP）标记的二级抗体，该抗体来自于白血病宿主，被涂在超顺磁珠上。这些珠子通常用于微流控免疫检测，以获得更大的表面积和体积比，也便于将抗体运送到微流控设备内所需的位置。

该便携式手持平台用于在不到6分钟的时间内检测这种菌株，以及冰山生菜中的大肠杆菌K12（10 CFU mL -1）。

该检测是基于颗粒免疫凝集的形式，其中颗粒被涂上抗体（或在其他一些情况下，抗原）并与分析样品混合。

在这里，生物识别事件有利于颗粒的聚集。虽然目测可以用来观察沉淀物，但光散射可以用来在没有沉淀的情况下检测阳性信号，这大大增加了检测的灵敏度，并减少了检测中所需要的抗原数量。

因此，基于微流控技术的颗粒免疫凝集试验允许快速而敏感的病原体检测，通常达到单细胞水平。菌株特异性的兔多克隆抗体被固定在乳胶微粒子（920 nm）上，无涂层的粒子用于参考。

通过使用米氏光散射，允许进行差异化检测，这最大限度地提高了凝集的微粒子的光散射强度，减少了分析样品基质的散射强度。因此，这个便携式设备代表了另一个整合微流控通道、抗体和先进检测策略以促进快速和敏感的细菌检测的优秀例子。

最近的一个例子表明，在检测细菌病原体时，如何利用配套的信号放大策略的整合来显著提高检测质量，例如，将线性微反射器集成到透明的聚合物层中，该层作为一个光学传感表面，并加入了磁性颗粒以实现光阻断。

预浓缩的样品被捕获在一个抗体修饰的微流控基质上，这种优雅的方法的功效被出色的检测灵敏度所证明，特别是允许检测4000个细胞的Rickettsia conorii，地中海斑疹热的致病因子。

当用微型平台检测病原体时，如果要在分析样品（如水）中同时检测多种细菌菌株，高通量分析可能是理想的选择。

一种基于PMMA的「芯片实验室」免疫检测平台被开发了出来，通过制造9.5毫米长的微通道（宽度为15 μm，深度为80 μm），促进了对八个单独样品的分析。

该方法的功效展示使用了一种山羊宿主衍生的多克隆抗体，通过EDC/NHS偶联将其共价固定在光活化的PMMA上。显微镜被用来观察结合的大肠杆菌O157:H7细胞，随后通过使用市售的非酶解缓冲液将其从微流控通道中移除。

定量实时聚合酶链反应（qPCR）促进了计数，检测极限在6到10个CFU之间。使用黄体小球菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为对照细菌菌株，证明了检测的特异性。

虽然这种测定显示了出色的灵敏度和特异性，并代表了一种新的免疫诊断「芯片实验室」平台，但这种测定需要大约5个小时才能完成，并需要外部仪器。因此，随后的原型开发将受益于整合基于PCR的这种和其他病原体的基因分型。

细菌病原体可能以微量存在于分析样品中，因此，检测灵敏度是最重要的。

在「芯片实验室」免疫诊断平台中，可以通过使用先进的检测方法来提高灵敏度，如安培检测，它通常利用一种酶系，产生一种可在工作电极上氧化或还原的电活性产物，通过电流的变化来监测生物识别事件产生的变化。

这里有一个很好的例子，该方法被用于检测牛奶中的大肠杆菌K12（100个细胞/mL待测物）。

最初使用多克隆抗大肠杆菌抗体检测细菌细胞，该抗体被捕获在链霉菌素涂层的磁性颗粒上。

接下来，通过监测辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体在氢醌存在下产生的过氧化氢（H2O2），可以进行电化学检测。

在以50μL/分钟的速度注入微流控系统后，酶产品沿着微通道（PDMS）被泵送，并由一组集成微电极进行安培检测。

仔细设计「芯片实验室」免疫检测平台的微流控部件可以进一步提高测定性能，最大限度地减少分析样品与电极的接触，这减少了结垢的可能性。

「芯片实验室」免疫检测也已经为其他细菌病原体开发。其中包括李斯特菌，一种潜在的威胁人类生命的病原体和李斯特菌病的致病因子。

为了检测去离子水中的这种病原体，一种的微流控免疫检测被开发了出来，其中正电泳（DEP）被用来集中和分类细菌细胞。

DEP的工作原理是，当放置在非均匀电场中时，二极化实体的电动运动，当应用于细胞分离的目的时，这要求目标细胞的电介质特性与非目标细胞的电介质特性不同。由于情况往往不是这样，DEP可以与免疫检测相结合，以提高检测的特异性。

该微流控装置包括一个由氧化物覆盖的、相互交错的钛/铂电极组成的阵列，这些电极排列在一个硅基底上，被封闭在PDMS内。

通过捕获生物素-BSA/链霉蛋白DEP通道表面，将生物素化的单克隆抗李斯特菌抗体固定在交错电极阵列顶部的氧化硅（SiO2）表面，并使用注射泵和气密式鲁尔锁注射器将细菌细胞引入微流控结构。

在连续流动条件下，观察到大约90%的细胞被保留下来，这证明了使用DEP进行单核细胞分拣的功效。有趣的是，当这种病原体与其他细菌菌株（包括产气肠杆菌和粪肠球菌）一起测试时，会发现当正向DEP关闭时，只有抗体捕获的细菌细胞被保留在微流控通道内。

此外，在DEP下，李斯特菌细胞的免疫检测得到了加强，当细菌细胞（每5μL样本量10^1-10^3个）被选为待测物时，捕获效率在18~27%之间。因此，将DEP与「芯片实验室」免疫诊断平台整合的关键优势是能够分离和选择性地捕获具有类似电介质特性和尺寸的细胞，这项技术在微流控免疫诊断方面具有相当大的潜力。

使用基于微流控技术的平台的主要好处之一是能够制造出允许平行、多重分析的芯片，例如细菌细胞和相关毒素。后者包括葡萄球菌肠毒素B（SEB）和霍乱毒素，由于它们对人类健康构成了相当大的风险，开发可靠和敏感的检测策略也是一个重要的考虑因素。

为了证明多重分析的可行性，研究人员设计的基于流式细胞仪的PDMS微型制造的免疫检测，如同前面讨论的那样，微流控设计增强了样本输送，使其能用于检测细菌细胞（大肠杆菌、李斯特菌属和沙门氏菌属）和毒素（SEB/霍乱毒素和蓖麻毒）。

夹心试验的形式整合了荧光编码和羧基功能化的微球，个别病原体或毒素特异性抗体被共价连接到上面。

使用生物素化、藻红蛋白标记的抗链霉菌素抗体促进了信号的放大，光学纤维被集成到芯片中以促进基于激光的检测。

细菌细胞的检测极限在1×10^3和1×10^5 CFU/mL之间。然而，整合毒素特异性抗体的能力是一个相当大的优势，这进一步证明了该平台和相关平台对结构多样化的待测物进行多重分析的潜力。

本研究的毒素检测限总结在表1中，该表还强调了其他基于「芯片实验室」免疫检测的细菌毒素检测的优秀案例。

表1 | 用于检测细菌毒素的「芯片实验室」免疫检测平台

虽然上面列举的例子涉及食源性病原体和毒素的检测，但也一直强调开发微型化平台来检测生物战剂，包括细菌孢子。

值得注意的是，这种分析也从使用大型、多组件平台，如的用于检测炭疽杆菌和耶尔森氏菌的早期基于流体的系统，该系统由几个独立的集成模块（如气溶胶收集器和多重免疫检测流式细胞仪检测器）组成，发展到多分析、小型化微流体免疫检测格式。

其中许多被设计用来提醒平民百姓注意潜在的恐怖袭击。

一个关键的例子是SpectroSensTM检测试剂，它允许对八种生物危险剂组合进行多重检测，包括炭疽杆菌、枯草杆菌、土拉菌和大肠杆菌。

与其他地方详细讨论的BiacoreTM （GE Healthcare）和Octet® （Fort´ebio）等市售平台类似，该系统在空间分离的波导通道内实时测量抗原与病原体和毒素特异性抗体相互作用产生的折射率变化。

通过使用精心设计的微加工，生产了一个安装在PMMA盒中的八通道微流控设备，允许在一次检测中检测八个不同的待测物。

为了准备用于这种小型化检测的表面，最初用氧等离子体清洗各个通道，并将硅烷化的表面与用于检测的光导纤维相连接。

检测抗体使用蛋白A/G捕获的初级抗体进行功能定位。关于样品输送，试剂通过一个基于注射泵的模块被引入微通道，通过计算调节样品引入的速度，随后添加危险物质，如细菌细胞和毒素，由一个蠕动的「基于泵」的「独立」模块来推动。

待测物和固定化抗体之间的生物分子相互作用有利于折射率的增加。在不到15分钟内平行检测一系列细菌和病毒病原体的能力清楚地表明了这个平台在快速检测生物战剂方面的功效，在低浓度（250 ng/mL）下也能检测到蓖麻毒素，并增强了其在国防监测方面的应用。

好了，以上就是今天分享的全部内容，如果大家有什么疑问，欢迎在后台给我们留言，或者加入我们一起讨论，若觉得文章不错，也请关注我们，以免错过后续更新~

来源：诊断科学