大家好，在上一篇文章当中，我们讨论了「芯片实验室」的基材选择和原型设计，今天我们就来讨论一下液路设计和抗体包被。

传统的免疫检测，如在有96个或更多样品孔的微孔板中进行，通常需要至少六个连续的步骤，即：

（i）样品制备；

（ii）通过移液引入测定成分（如抗原、抗体）；

（iii）孵化；

（iv）用缓冲液如磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，用于去除未结合的抗体；

（v）加入底物；

（vi）检测（如比色/荧光）。

这些过程对于「芯片实验室」的应用是类似的，而且实施创新的待测物输送和随后的清洗策略被证明可以提高免疫检测的灵敏度和性能。

在许多情况下，通过微流控通道输送试剂溶液可以通过压力驱动的流动来完成。例如，选择一个带有30号针头的1.0mL注射器，并将其直接插入离废液通道最远的一端的微通道中。

在这里，有可能以一种可控的方式依次引入分析溶液。此外，一个额外的注射器被用来从废液池中取出液体。

对于基于ELISA的分析，抗原要直接固定在表面上，这可以通过移液到孔中并被动地固定过夜（例如在室温或4℃下）来进行。通过注入PDMS微装置的单个微通道，来捕获裂解物抗原的能力已经被证明，在这种情况下，抗原是幽门螺旋杆菌和大肠杆菌O157:H7的细菌菌株，可以通过被动固定捕获。

与传统检测类似，未结合的抗原通过在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中清洗而被清除。

尽管微流控设备的尺寸缩小了，但待测物在微通道中的传输是有限的，尤其是当它们处于低浓度时。

此外，进一步减少通道尺寸以适应这种情况并不总是可行的，因为这可能有利于增加流体阻力和损害质量运输。

因此，可以开发替代策略来克服这个问题，在一篇报道中，一个基于微芯片的流动限制系统被开发了出来，允许将微小的分析量快速输送到PDMS表面，以有效地捕获抗体。

在层流条件下，样品作为一个薄层被保持在靠近表面的地方，这导致了速度的增加。为了证明这种流动限制方法的功效，选择了氮化硅波导作为基底，在三氟甲基二氮杂环素的存在下捕获兔IgG，并以不同的流速通过通道进行流体动力学泵送荧光检测抗体（氰基5，Cy5标记的抗兔IgG），以调节流动限制的程度。

虽然报道确实得出结论，这种新方法确实大大减少了进行免疫检测所需的分析试剂的数量，超过90%，但也指出，待测物通过扩散损失到封闭层是一个限制因素。

尽管有这个明显的局限性，但这种方法和其他传递系统的整合，例如下面详细讨论的用于浓缩和分拣细菌细胞的正电泳（DEP），是提高「芯片实验室」免疫检测性能的重要考虑因素。

改善待测物捕获的另一种策略是基于将混合元件整合到微流控设备中。有报道指出，可以通过使用软光刻技术在PDMS微通道的顶部压印了图案槽。

这里的关键优势是，穿越通道的流体被重新定向，以改善目标待测物从散装流体向设备表面的输送，此外，这被证明可以防止待测物在边界层的耗尽。

作为这种增强混合以改善免疫检测性能的能力的证明，将一个涂有中性粒细胞素的显微镜载玻片插入微流控装置，并作为底物用于捕获生物素化的初级抗体（兔抗肉毒杆菌IgG）。

夹心试验的形式涉及检测肉毒杆菌毒素（250 μg/mL），并使用CY5标记的二级抗体进行检测。原生和开槽通道之间的比较分析表明，后者的配置导致荧光信号强度增加26%，这归因于通道内的连续混合。

有一种小型化的微制造流式细胞仪被开发了出来，允许对细菌细胞和毒素进行多重检测。该平台的一个关键设计特点是能够整合流体动力聚焦，以类似于微流式细胞仪的方式，通过护套促进颗粒在微流道中的单行运动。

通过共聚焦显微镜监测罗丹明染料在通道中的流动，从而证明了这一点的有效性。

PDMS平台被制作成类似雪佛兰车标那种凹槽的形状，这有利于流体从通道的两侧向中心移动，这样将样品集中到一个狭窄的直径区域，可以通过基于光纤的检测进行多次的检测，从而提高检测的灵敏度。

另外，优化洗涤步骤对免疫检测的性能有积极影响，这也适用于「芯片实验室」的应用。有一种基于流体力判别（FFD）的洗涤方法，用于减少待测物的非特异性吸收，反之，提高检测灵敏度。

FFD的原理是用微珠标记捕获在微测定表面的待测物，用受控的层流除去未结合的微珠。

因此，待测物浓度的增加会导致更多的微珠被保留下来，这可以通过光学检测来验证。

利用涂有抗体或oligo（dT）25探针的珠子，分别检测蛋白类（Ricinus communis凝集素II、蓖麻毒素A、肌钙蛋白I和IgG）和核酸类目标（单链DNA），并证明这两个目标的灵敏度为飞摩尔。

此外，还证明了基于FFD的检测方法能够同时平行检测两种待测物。

「芯片实验室」的免疫检测配置可以是异质性的，也可以是同质性的。

同质性免疫检测涉及溶液中的抗体和抗原之间的相互作用，对于基于微流控技术的免疫检测，结合和未结合的抗体通常通过它们在微通道中的电泳移动特性进行区分。

相比之下，异质检测通常使用直接固定在微型设备表面的抗体，或者将其交联到集成在设备中的微米大小的珠子上（图1）。

图1 | PDMS快速成型、模具制造和复制成型的过程示意图。对于模具制造，层A、B和C分别是光罩、光刻胶和硅，黑色箭头代表光。1和2是可重复使用的母版。

抗体固定化策略的功效对检测性能有深远的影响，特别是对灵敏度的影响。蛋白A和G对全长抗体的功能定位已经在其他地方详细描述过了，这些生物配体可以用于「芯片实验室」的检测形式，将抗体以功能的方式固定下来。

1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）/苏尔埔-N-羟基琥珀酰亚胺（SNHS）-基于共价结合的全长抗α-2-HS糖蛋白（fetuin A）抗体，与随机（被动固定）和定向（蛋白A）策略相比，在表面上的抗体沉积更大。

由于互补性决定区域（CDRs）在功能上是定向的，因此导致了更高的检测灵敏度。

微流控应用中抗体的共价连接也可以通过使用不同大小的柔性连接体来加强，以规避与可及性和立体阻碍有关的问题。

有许多连接剂可以选择使用，从短的（如3-氨基丙基三乙氧基硅烷，APTES）分支到更灵活的结构，如那些由使用聚乙烯亚胺（PEI）赋予的。

例如，使用一种抗阿特拉津多克隆抗体进行生物识别，并使用三种连接剂格式进行固定，即APTES、PEI（线性和支链）和3-缩水甘油基丙基三甲氧基硅烷（GOPS）。

当对检测灵敏度进行比较分析时，发现较长的基于PEI的连接体比较短的基于APTES的连接体具有更大的检测灵敏度（线性PEI和APTES分别为3.8 ng/L和45 ng/L），这表明增强的灵活性有利于增加与抗原的结合，在这种情况下就是阿特拉津。

而PEI相对于其他胺化化学品，即六亚甲基二胺（HMD）、1,3-二氨基丙烷（DAP）和聚烯丙基胺盐酸盐（PAH）而言，能够提高IgG在PMMA上的固定性。

同时，较大的间隔距离赋予了更大的灵活性。

在展示这种固定化方法的功效时，基于PMMA的微流控检测与96孔格式的ELISA检测平行进行。

「芯片实验室」平台的通道尺寸较小，将检测时间缩短了10倍，观察到的待测物的动态检测范围（5 ng/mL- μg1/mL）比传统的ELISA（2-100 ng/mL）要宽。

通过使用微接触印刷和微流控图案的组合，通过EDC/NHS耦合在APTES功能的玻璃表面沉积五种抗体。由此产生的由五种功能定向的抗体组成的微阵列，包括抗CD36、抗CD31和抗CD34，清楚地表明了使用这种方法在一个小型化平台上生成能够进行高通量免疫检测的表面的可行性。

有趣的是，其他几个独特的固定化策略也被开发出来用于微流控应用。

通过将由1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和磷脂酰胆碱组成的囊泡与氧化的PDMS微通道融合，以减少非特异性的结合，从而产生了支持的双层膜。生物素化的抗体，在这种情况下是指葡萄球菌肠毒素B（SEB），通过在该脂质层中加入链霉菌素来捕获。

人们注意到，与未经处理的通道相比，非特异性结合减少了100多倍，而且该检测的灵敏度为0.5 ng/mL，这表明了这种方法的有效性。

有研究人员使用电纺技术将聚偏二氟乙烯（PVDF）纳米纤维膜沉积在PDMS通道上以增强蛋白质的吸收。

在这里，这些表面被用来捕获来自白血病、毛猪和人类宿主的全长IgG抗体。虽然这似乎是一种固定生物分子的独特方法，但使用这种膜可能有助于提高检测的灵敏度。

对PDMS的非特异性吸收也可用于有效地耦合蛋白质，一个例子表明了如何通过使用疏水性蛋白，即表现出「表面活性剂」性质的半胱氨酸蛋白（7-15kDa）来加强这一过程。这些蛋白来自真菌，包括双孢蘑菇和毛霉菌，并在菌丝壁和分生孢子的外表面发现。

II类疏水素也具有自组装成两亲膜的能力，例如在PDMS-水界面，并改善亲水性。图案化的疏水性PDMS表面被用来捕获鸡的IgG，随后被异硫氰酸荧光素（FITC）标记的来自白血病宿主的二级抗体检测。

随后通过X射线光电子能谱（XPS）和水接触角测量证实了该表面的「润湿性」的增强。

基于这些技术，一个PC-PDMS混合微芯片被开发出来，用于检测流感病毒颗粒。他使用了一个环氧树脂-硅溶胶基质上捕获了初级（检测）抗体。除了提供功能定向的抗体（共价捕获），同时，在制造过程中溶胶凝胶的整合导致了PDMS基底和聚碳酸酯支撑之间的强粘合，关键是观察到的背景荧光很低。

虽然上述策略导致了功能定向和固定化的抗体，但应该强调的是，物理吸收往往会对检测性能产生有害的影响，因为它基本上产生了一个异质的表面，抗体以非均匀的方式定向。

这可能会导致不利的定向、变性，在某些情况下，还会产生立体阻碍。因此，在开发「芯片实验室」免疫检测平台时，这种方法并不总是理想的，提出功能取向的抗体的策略是更可取的。

好了，以上就是今天分享的全部内容，如果大家有什么疑问，欢迎在后台给我们留言，或者加入我们一起讨论，若觉得文章不错，也请关注我们，以免错过后续更新~

来源：诊断科学