在上一篇文章当中，我们介绍了PCR的干扰因素，今天我们将介绍核酸提取的质量标准和检测方法。
1、核酸提取的质量标准
为分子诊断分离的核酸需要有尽可能高的质量和纯度。在分离过程中，干扰物质去除不充分和对目标区域的损害是最大的风险。
由于3′-5′-糖-磷酸盐桥的水解，很容易发生单/双链断裂和/或碱基损失的片段。这些问题可能发生在隔离之前、期间和之后（浓缩期间）。
采样后和运输过程中，酶促过程（DNase和RNase）是最重要的。在分离和储存过程中，非酶性水解造成的片段化增强了出现假阴性结果的机会。特别是，反复的冻融循环是（可避免的）风险。
核酸的质量、纯度（在分离和提取程序之后）和浓度可以通过各种方法确定。所需的浓度尤其取决于诊断问题。
在作为阳性对照的材料中，DNA或RNA的浓度，或目标的数量是已知的。
例如，在有未知病原体的临床材料中，浓度测量是不可能的，也没有必要，而只有存在或不存在是结果。相反，在法医材料或确定基因表达不足/缺失的样品中，测量样品中的浓度是必要的。
紫外线吸收（OD）大多被使用/应用，凝胶电泳也是如此，有时使用DNA/RNA插层染料进行测量。
紫外吸收是最简单和容易的一种。它也能提供最多关于污染性蛋白质和其他物质被去除程度的信息。紫外测量并不能提供样品中存在的目标物的数量信息。
例如，一个众所周知的问题是少量的原核生物目标DNA或RNA在大量的真核生物（宿主）DNA中无法被检测到。
对DNA和RNA样品可能的污染物的吸收最大值：
➤ 230纳米：胍盐（用于促进DNA附着在硅酸盐上）和苯酚；
➤ 280纳米：酪氨酸和色氨酸；在280纳米处的吸收表明蛋白质仍然存在；
➤ 320纳米：浊度，为校正浊度，确定A260-A320。
2、电泳法
电泳可以很好地了解完整核酸的存在，因为它是根据分子大小来分离的。低分子产品表明是水解的核酸。
在DNA中，存在大约10kbp的高分子部分是合适的材料的良好标志（见图5.13）。变性后，纯化的mRNA必须在产品尺寸为8-10kb时可见条带。18和28S rRNA条带是总RNA质量的指示，如图1所示。
图1|使用变性电泳对RNA进行质量控制
a 使用福尔马林对总RNA进行经典的变性琼脂糖凝胶电泳。泳道1，分子量标记（细分为0.5-9kb）；泳道2，水解后的片段RNA；泳道3，完整的RNA。
b 使用安捷伦生物分析仪进行RNA质量控制的凝胶扫描和电泳图像。RNA完整性编号（RIN）是对完整的RNA（28S/18S比率）和可能的片段之间平衡的定量测量。测量的依据是18S和28S RNA峰的峰面与背景的关系。
通过凝胶扫描可以进行量化：高的RNA完整性编号（RIN）表明RNA的质量好。
使用琼脂糖凝胶对DNA或RNA分离物进行直接电泳的灵敏度是有限的（25 ng/3 μL）。基于纳米技术的Bioanalyser（安捷伦）和类似的设备，在3 μL的体积中，分析测量范围为5-500pg，其灵敏度与紫外光谱仪处于同一数量级。
3、紫外光谱法
即使是最小的样品（1~2 L）也可以用紫外光谱法进行测量。DNA、RNA和单个核苷酸和寡核苷酸在260纳米处吸收紫外线。在1厘米的比色皿中，1.0的A260相当于50 μg/mL DNA和40 μg/mL RNA。
A260/A280比率提供了关于分离的核酸纯度的信息。纯的DNA和RNA的比率分别为1.8和2.0。
污染物如蛋白质、苯酚通常以不同的波长吸收光线。如果在230、280或320纳米处也有吸收，这表明分离物中存在杂质。如果该比率小于1.8，则可能是蛋白质的污染。A230/260的比率>1也说明了这一点。
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来源：诊断科学
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