在前面的系列文章中，我们介绍了DNA和RNA，今天我们将对核酸的分离和纯化进行介绍。

分子诊断是在各种材料或样品上进行的。这些样品可以是人类或动物来源的（血液、粪便、尿液、体液、细胞或组织）、植物细胞或食品样品。因此，对于分子诊断来说，第一步是从样品的结构成分中分离出核酸，而这些结构成分常常被我们称之为基质。

可以采用许多方法从基质中分离出目标核酸，例如机械破坏植物和真菌的细胞膜或细胞壁、酶处理、使用添加剂、有机溶剂使细胞可渗透、加热或把上述的方案组合起来。

仅仅破坏细胞的完整性还不足以产生最佳数量的核酸。

有机溶剂或洗涤剂如Triton X-100或Tween（可溶解脂肪成分）有助于裂解细胞，而用蛋白酶如蛋白酶K对蛋白质、细胞碎片进行酶解，往往是释放核酸的必要条件。

有时，需要使用机械力量，如切碎和研磨或使用杵和臼对深冻的植物组织进行处理。

将可能干扰PCR的物质释放到溶液中是很重要的，这可以使它们在纯化步骤中与核酸分离。许多这些物质通过抑制（或激活）PCR酶而妨碍分离步骤和/或PCR反应本身。

此外，它们可以通过屏蔽核酸（如粘液、植物细胞壁的木质素、脂肪成分）来阻止核酸的释放。

干扰物质可以破坏（通常是水解）或吸附释放的核酸，比如，福尔马林固定和石蜡包埋对核酸的分离和完整性造成了其他问题。

核酸分离和纯化的目的是以最佳方式将DNA和/或RNA从所有其他细胞和细胞外成分中分离出来并进行纯化。

纯化可以去除所有（细胞外）成分和其他干扰物质。后者可能来自于基质和用于分离的生化试剂。

一般来说，基质成分会产生负面影响（吸附、抑制和水解），而生化试剂会刺激或抑制检测，如PCR，这取决于生化试剂的浓度。创造一个可以提纯DNA和/或RNA的水环境是非常重要的。

一旦细胞的完整性被打破，许多可能干扰PCR结果的因素就会释放到溶液中。尽管粗制的分离物就可以作为PCR的样本，但考虑到PCR反应的成功性，大多还是会采用纯化步骤，尤其是涉及到容易迅速分解的mRNA时。

现在常规分子诊断中使用的大多数程序都是基于核酸和硅酸盐的亲和力结合，同时洗掉所有其他成分。

通过这种方式，可以得到几乎只含有核酸的纯化洗脱液。

以前，核酸研究的金标准是苯酚-氯仿-异戊醇萃取。这种方法在很大程度上已经被新的方法所取代，这些方法花费的时间更少，产生的有毒废品更少，而且应该对许多常规应用足够有效，如图1所示。

图1 | DNA分离方案的七个例子

每个方案都从原始的核酸样品开始，最后得到或多或少纯化的核酸溶液。不同的程序可以结合起来，并可能导致最终的核酸溶液的纯度提高。

几乎所有取代苯酚-氯仿-异戊醇提取的方法的关键步骤是使用Boom法（见本文第三部分内容），通过这种方法，核酸被存在于磁珠或滤膜上的硅酸盐颗粒捕获，如图2所示。

图2 | Boom法：使用硅酸骨架和硅藻进行DNA的硅酸盐和亲和色谱法

硅酸盐为核酸在过滤器、柱子和磁拍上的固定化提供了一个通用的基质。钠离子和核酸的磷酸盐基团（DNA和RNA）之间将发生离子结合反应，水和混沌盐的存在。现在，污染物可以用离心法洗净。纯化后的核酸可以再次解离。

a 硅藻的外部骨架的例子。来自骨架的硅酸盐的极其有利的表面-体积比实现了核酸和载体之间的最大相互作用。

b 对核酸和硅酸盐在混沌盐存在下的相互作用的化学解释。

某些盐类，如LiCl和异硫氰酸胍（GuSCN），在水环境中选择性地使蛋白质变性。DN酶和RN酶也会变性，从而被GuSCN灭活。因此，蛋白质可以从高分子核酸中被去除，而高分子核酸则留在溶液中。

离心法也可用于分离相关的馏分，例如去除红细胞和/或白细胞。

为了从植物材料中分离出高质量的DNA，这种DNA需要从高分子蛋白质/结合物（来自细胞壁/木纤维）和淀粉中分离出来。

由于这些材料具有与DNA类似的化学和物理特性，因此出现了分离的问题。新的提取缓冲液中含有更具侵略性的成分（CTAB、N-月桂酰肌氨酸），有助于将DNA选择性地保留在溶液中。

大型深冻样品可以用研钵和研杵研磨。如果基于Boom-/Silicate的方法的回收率不足，有专门的方案和方法用于分离核酸。

为了获得高质量的mRNA，基于GuSCN和苯酚-氯仿的方法仍然是脂肪和纤维样品的首选方法。

然而，对于一些非常困难的基质，比如粪便、血液、尿液和固定和/或嵌入石蜡的材料，都需要在实施前用各种方法测试相应的分子技术和样品运输。

RNA的分离和纯化通常与DNA的分离和纯化相类似。在这两个过程中，细胞的裂解和细胞大分子的溶解是必不可少的。

RNA可以通过离心、沉淀或在poly（dT）（真核细胞mRNA）上进行亲和层析从DNA中分离出来，如图3所示。

图3 | 真核生物mRNA的亲和层析法（poly-A捕获法）

（1） 样品悬浮在裂解缓冲液中；核酸（RNA）将在可溶相中。

（2） 生物素标记的oligo （dT）20与裂解液混合；poly-A/RNA与oligo （dT） 探针杂交。

（3） 将50升混合液加入微孔板（或反应容器）中涂有链霉素的孔中。生物素将以高亲和力与链霉菌素结合（CSA）。

（4） 用缓冲液洗三次，与oligo （dT）探针解离。现在样品已准备好进行PCR。

用DNase处理可完全去除RNA部分的DNA。由于mRNA被迅速降解（通过破碎或被非常稳定的细胞质和其他RNase（如来自上皮细胞）水解），某些预防措施是分离足够的代表性mRNA的先决条件。

rRNA比mRNA更稳定，因为它与蛋白质相关。一旦rRNA游离在溶液中，它就会像mRNA一样，暴露在各种RNases中。

这些RNases可以在手上、溶液中、空气中、玻璃器皿上和实验室设备上找到。工作程序（如不含RNases的工作）旨在灭活细胞中的RNases并防止含RNA的材料接触「外部世界」。

因此，所有的溶液和玻璃器皿都经过高压灭菌处理，或买来的时候就经过了处理，使其不含RNases。

在工作中，要戴上手套和/或使用RNase抑制剂。这方面有各种化学品可供选择，每一种都有其特定的功能（DEPC、RNasin、RNA later）。

同时，那些含有甲酰胺的介质，如RNA later，可以防止RNA降解，用它可以取得良好的效果，特别是在处理组织时。

在分离RNA时，可以分离ERM RNA或Total RNA。大约需要106个哺乳动物细胞才能分离出1毫克的总RNA。

即使是低表达量的mRNA也能得到足够数量的回收。真核生物mRNA可以通过聚（dA）尾部与磁珠或含有聚（dT）的膜杂交从粗提物中分离出来。洗去所有其他物质后，用不含RNase的水将mRNA部分与oligo（dT）解离，如图3所示。

Boom在1990年开发了一种方法，利用二氧化硅颗粒手工分离核酸，该颗粒与核酸的磷酸基团形成可逆的盐桥。通过这种方式，可以从基质中捕获核酸，如图2所示。

这些二氧化硅颗粒可以被离心分离，并与分离物中的其他成分分开。丢弃上清液后，可以加入洗涤缓冲液来重新悬浮颗粒，然后再次离心。

通过一些清洗和离心步骤，硅酸盐/DNA复合物与污染物如蛋白质、脂质和其他（大）分子分离，而不像苯酚-氯仿提取那样使用有毒物质。

通过将二氧化硅颗粒与各种载体（例如顺磁珠）耦合，有可能简化和自动完成洗涤步骤，并相对容易地从复杂的溶液中分离出DNA。

在洗涤步骤之后，核酸在小体积的低摩尔的缓冲液（含10mM TrisHCl/0.1mM EDTA pH 8.2）中从二氧化硅颗粒中被洗脱出来。纯化的核酸可以被定性并立即用于进一步的步骤。

如今，Boom方法被纳入了自动化系统。通过这种方式，许多样品可以以标准化和无污染的方式被分离出来，这对诊断实验室来说是至关重要的。

自动化提取设备有许多形状和尺寸，为小量、中等量或非常大量的样品进行了优化，专门处理DNA、总RNA或mRNA。通过确定从加注的模型材料中的回收率，可以确定产量。

但需要注意的是，根据报道，各种商业系统在产量、纯度和完整性方面有很大差异。

为了保存核酸分离物，可以将洗脱缓冲液蒸发掉，得到易于在室温下保存的固体亲水粉末。在使用前，通常将该粉末溶解在相同体积的无核酸酶的水中。另一种方法是将洗脱液冷冻，储存在-20℃或-80℃。

来源：诊断科学 

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