在IHC系统中，与感兴趣的组织抗原结合的一级抗体通过检测标签被可视化，该标签可以在抗体结合部位产生可见的色素或荧光信号。

本问描述了IHC检测发展的第一步：选择一个或多个Abs作为候选主Abs。一般来说，如果候选的主要抗体与目标抗原的结合一致且可重复，不与组织中的其他非目标抗原明显结合，并产生与诊断相关的生物标志物表达范围相关的信号强度，则可能产生有用的结果。

许多IHC检测方案还采用了二级Ab（即与一级Ab特异度结合的Ab），有些甚至使用三级Ab。虽然这里没有明确讨论，但这些抗体也必须仔细选择，因为它们的性能将直接影响观察结果。

产生与特定生物标志物抗原特异度结合的抗体的第一步是用含有目标生物标志物分子（或其一部分）的免疫物质对动物宿主（如小鼠或山羊）进行免疫。由此产生的免疫反应将包括产生分化的B细胞，每个B细胞表达一种独特的抗体。

这些抗体在其抗原结合变量（Fab）区域上有所不同，因此对目标抗原本身和其他可能的抗原的特异度和亲和力也有所不同。

它们在与抗原结合的确切位置（表位）上也会有所不同。即使一些被识别的表位重叠，Abs也会对抗原有不同的特异度和灵敏度。

此时可以从动物宿主的脾脏或淋巴结收集B细胞，并单独与不朽的骨髓瘤细胞融合，形成不朽的嵌合细胞，称为杂交瘤。当在细胞培养中或在动物宿主体内生长时，每个杂交瘤细胞将产生一个由相同子细胞组成的克隆群，每个子细胞都分泌由其母体B细胞表达的独特Ab。

杂交瘤克隆可以在细胞培养中维持，或注射回动物宿主体内，在那里将产生含有高浓度单克隆抗体（mAb）的腹水。含有mAb的培养液或腹水可以通过亲和层析法进行纯化，或以粗制的形式使用。

在另一种生产抗体的方法中，最初由动物宿主产生的分化的B细胞不会立即被收获。相反，动物被反复地用免疫原进行再免疫，间隔时间为几周。反复免疫使B细胞成熟为不同的浆细胞克隆，每个克隆都会增殖并产生大量的独特抗体。从免疫动物身上提取的血清将包含来自这些不同浆细胞克隆的循环抗体，因此被称为多克隆抗血清。

尽管它可以以粗制的形式使用，但多克隆抗血清在使用前通常通过亲和层析法进行纯化。这个过程消除了几乎所有识别感兴趣的抗原以外的目标的抗体，大大提高了抗血清的抗原特异度。这种纯化的抗原特异度抗体克隆的集合构成了多克隆抗体（pAb）。

因为每个mAb都结合（识别）一个表位，而pAb识别多个表位，mAb在IHC系统中通常产生较少的背景染色。另一方面，pAb识别的多个表位可能使其表现出更高的抗原灵敏度和更强的结合信号，使其可以在更高的稀释度下使用，从而降低了每次测试的成本。

此外，由于pAbs的结构和特异度是异质的，如果目标抗原结构被改变（例如，被过度固定），它们比mAbs更不可能失去所有的功能，而且更有可能在广泛的pH值和盐浓度范围内保留一些功能。

然而，pAbs的主要缺点之一是它们在不同的批次之间存在差异。不仅不同的动物宿主注射相同的免疫原所产生的抗血清会有很大的差异，而且一只动物的抗血清在反复的免疫循环中也会有所不同。因此，单个pAb批次的染色特性可能在某种程度上有所不同。因此，在临床应用中，由于mAbs具有更高的一致性和特异度，通常比pAbs更受欢迎。

动物宿主的选择会影响所产生的抗体的效用。

相对于小鼠pAbs，兔pAbs通常对抗原表现出更高的亲和力，并识别更多的抗原表位。与使用小鼠mAb的IHC程序相比，使用兔mAb进行主要抗原检测的IHC程序也不太可能需要进行抗原修复（解掩）步骤。

与使用相同程序的小鼠pAbs相比，兔pAbs更高的工作稀释度和更少的劳动力也降低了每次检测的成本。

乳腺癌中雌激素受体（ER）状态的IHC检测的历史可以说明问题：几年来，克隆1D5（一种针对（人类）ER的小鼠mAb）被认为是IHC检测ER阳性肿瘤的最佳Ab，因此可以识别可能受益于内分泌治疗的患者。

然而，后来用兔子生产的抗ER mAb（克隆SP1）对ER的结合亲和力是1D5的8倍，并表现出更高的临床灵敏度。因此，根据NordiQC质量控制组织的数据，SP1已经取代了1D5，成为许多IHC实验室的首选抗ER抗体。

由于特定生物标志物的IHC结果可能随mAb克隆的选择而变化，并可能因此影响患者的治疗，一些医学协会已发布指南，推荐使用特定的克隆。

例如，美国病理学家学会（CAP）和美国临床肿瘤学会已经公布了对乳腺癌组织中ER、孕酮受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）检测的具体克隆建议。在选择特定的抗ER、抗PR或抗HER2 mAb用于临床时，应始终考虑这些指南。

为那些试图选择mAb克隆的人提供的在线资源包括：NordiQC，它提供测试的方案和组织建议，以及对不同供应商的Ab克隆的评估；Human Protein Atlas，它提供各种正常和肿瘤组织的蛋白质表达数据和高分辨率IHC图像；以及Antibodypedia，一个互联网门户，Ab供应商通过它分享IHC、Western blot和免疫荧光的验证数据。

应仔细审查供应商提供的声明和数据，因为它们的准确性在不同的制造商之间可能有很大的差异。

没有两个mAb克隆（或pAb批次）在所有条件下的灵敏度和特异度特征是相同的。针对同一抗原的mAb克隆会以不同的亲和力识别不同的表位，而且在不同的情况下，识别的表位的相对可及性可能会发生变化。因此，正在考虑开发的任何Abs必须经过彻底的特异度审查。

在常规的研究环境中，特异度通常是通过亲和力结合试验来评估的。这些技术中最广泛使用的是Western Blot法。这种技术通过一个固定的基质将混合物（如含有目标抗原的细胞裂解液）中的分子按照其分子质量进行分离，从而形成阶梯状的分子带。

如果混合物中的目标抗原被随后应用的Ab识别，那么产生的Ab-抗原复合物预计可在与抗原质量相对应的位置检测到一条带子。如果在不适当的质量位置检测到其他条带，它们可能代表Ab与混合物中存在的其他非目标抗原的复合物。

然而，在Ab被拒绝用于IHC之前，应该探讨对意外条带的其他解释，如翻译后修饰、分解产物或剪接变体。

Western Blot的结果并不总是与IHC结果相关。例如，为Western Blot准备的样品可能会改变目标抗原的结构，以至于它不再被Ab识别。另外，由于用于IHC的固定过程可以扭曲或掩盖一些抗原，在Western Blot中工作良好的Ab可能在固定的组织中不能识别其目标抗原。因此，如果Western Blot法产生不理想的结果，应该考虑其他的特征分析方法。

最终的候选抗体克隆必须在预定的IHC检测系统中使用适当准备的（如FFPE）阳性和阴性检测对照组织进行评估。包含多种正常和肿瘤组织样本的石蜡块（组织微阵列块）可用于筛选，具有已知目标抗原表达水平的嵌入式细胞系也是如此。细胞系在评估具有目标抗原的Abs时特别有用，这些抗原在疾病管理中被半定量地评分（如HER2）。

目标生物标志物的亚细胞定位，如果还不知道的话，通常可以从其生理功能中逻辑推断出来；因此，针对该生物标志物的抗体产生的IHC染色模式可以用来初步评估该抗体的潜在效用。例如，一个转录因子预计会有一个核染色模式；如果针对特定转录因子目标的抗体同时产生核和膜染色，那么该抗体对目标的特异度不够。

在对最终的候选抗体的染色方案和稀释度进行优化后，可以用同一组组织直接比较克隆的染色模式、强度和特异度，并与文献中的任何发现相联系。适当的细胞结构与适当的核、膜和/或细胞质亚细胞定位的染色应该被确认。

具有反常染色或高度非特异度染色的克隆可以从考虑中排除。如果对细胞系进行测试，最好能显示出与已知的抗原数量一致的染色强度动态范围。可以通过让不同的操作者在不同的日子对同一组织的一式三份样本进行染色来评估重复性。根据这些初步实验的总体结果，可以选择最有希望的克隆或pAbs进行进一步开发。

通过选择在各种参数范围内对目标抗原表现出强大免疫反应性的主要抗体，可以减轻分析前变异性的影响。在可能的情况下，检测开发商将选择在其标准化程序参数内工作的抗体。

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