PCR是分子生物学中常用的实验技术手段，在揭示生命现象规律方面发挥了至关重要的作用。目前在进行PCR实验操作时，因为PCR反应体系设计不合理而导致实验失败的事例较多。因此，从优化PCR反应体系的角度出发，对提高PCR反应效率进行探讨。

1，标准PCR反应体系

标准的PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应)反应体系由缓冲液、脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、引物、DNA模板等构成，每个部分在PCR反应中都有重要的作用，并且在合适的浓度范围内才能促进PCR反应的正常进行。

2，PCR反应体系设计

模板核酸

DNA模板是PCR反应复制的原始基础，模板质量的优劣，直接决定了整个PCR反应的成败。目前DNA提取方法主要有酚氯仿、高盐法及各试剂公司的试剂盒。酚氯仿作为传统经典的方法，一直受到科研工作者的青睐，其DNA提取质量与纯度较高，但是缺点是程序繁琐、提取效率低。目前在一些样品比较大的实验中，主要采用高盐法提取DNA。试剂盒提取DNA效率与质量都较好，但是费用较高。在PCR反应体系中，一般加入模板的质量为50～100ng，加入模板的量过多，或产生较多的杂质，出现很多非特异性产物；如果加入的模板较少，产生的特异性产物较少，在检测过程中不易检.

DNA聚合酶

DNA聚合酶是PCR反应中将游离的散碱基按照模板中碱基的顺序，连接于DNA双链中的粘合剂。目前DNA聚合酶主要有两种类型：一种是从水生杆菌中提取的天然聚合酶；另一种是利用大肠杆菌人工合成的基因工程酶。由于当前分子生物学的迅速发展，人工合成的基因工程酶越来越多地得到应用，在20ulPCR反应体系中，所需要的DNA聚合酶一般为2.5个单位。加入的NDA聚合酶过多，会引起很多非特异性扩增，产生没有用途的非特异性产物；相反，如果加入的DNA酶过少，则会减少特异性产物的产量。

脱氧核苷三磷酸(dNTP)

dNTP是合成DNA的原料，主要是4种碱基。dNTP是以干粉状态保存的，在进行分子实验时，需要利用缓冲液溶液和调节pH值，并且小量分装，保存在-20°C冰箱中。尽量减少反复冻融的次数，在PCR反应中dNTP的浓度一般在50～200lumol／L范围内。注意4种dNTP的浓度要相等，如果任何一种dNTP的浓度过低，产生错配的几率将会大大增大；如果dNTP的整体浓度过低，则会降低PCR反应中特异性产物的量；如果dNTP量过高，则会与M结合，降低Mg的浓度。

引物

引物中碱基与模板DNA互补的程度，决定了PCR产物的特异性，这也是PCR特异性扩增反应的关键环节。在设计引物序列时，一般遵循以下几个原则：

1)引物的长度一般在15～30bp之间，20bp为最优，过短或者过长都不利于PCR的特异性反应：

2)引物的扩增跨度在200～500bp为好，在特定情况下也可以将扩增片段增至10kbp：

3)3)引物的4种碱基中，3端含有G或者C可以提高引物的特异性，G、C的含量在40％～60％为好，太少或者太多都不利于扩增；

4)引物之间要避免碱基的互补，否则会出现发夹结构，这种二级结构阻止引物与模板的复性结合；特别要注意的是，引物之间不能有连续4个以上的碱基互补，否则产生的非特异性扩增条带会增多；

5)引物的最末及倒数第二个碱基要严格配对，避免引物末端碱基不配对而导致PCR的失败；

6)引物的序列与数据库中其他序列应无明显同源性，在引物中可以加上合适的酶切位点，有利于酶切分析和分子克隆。

Mg浓度

Mg对PCR扩增的产量和特异性有显著的影响。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol／L时，Mg浓度为1.5～2.0mmol／L为宜。Mg浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低，会降低DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

3，PCR反应体系的优化

反应体积的优化

PCR反应体积一般采用的范围为20～100ul，常采用的为20ul、30ul、50ul、100ul。具体在实验中采用哪种反应体系，要根据实验的目的和实验条件来决定。参考已公开的PCR反应体积，进行不同体积的PCR反应，各组分的质量和浓度不能单纯地扩大或者减小，一定要根据实验PCR扩增效果进行摸索，减少或者增加个别组分的质量浓度，最终得到合适的PCR反应体系。

引物扩增效率的优化

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度存在问题，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对此提出以下对策：

1)选定一个好的引物合成单位；

2)引物的浓度不仅要看0D值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致(如果一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决；如果一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度)；

3)引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融，或因长期放冰箱冷藏而导致引物变质，降解失效；

4)避免引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

PCR反应条件的优化

PCR的反应条件主要是温度、时间及循环次数。温度主要是按照PCR的三个步骤“变性一退火一延伸”设置的。一般的PCR反应，DNA变性温度为9O～95°C，退火温度为40～60°C，延伸温度为70～75°C；但是在实际PCR反应中，温度与时间的设置是统一在一起进行的。一般来讲，在93～94°C时，1min便可以使DNA变性；若低于93°C，设置的时间需要长一些；但是过高的温度会影响DNA聚合酶的活性。因此，退火温度与时间的设置一般在93～94°C时，1min退火温度、时间的设置决定于引物的长度、碱基及其目的片段的长度。

可参考以下公式选择合适的温度：

Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)

复性温度=Tm值一(5～10°C)

一般来讲，在解链温度允许的范围内，较高的复性温度可以提高PCR反应的特异性，复性时间一般在30～60S，足可以保证引物的模板的充分结合。

PCR的延伸温度一般设置在70～75°C，常用为72°C，过高或者过低的温度都不利于引物与模板的结合。PCR的延伸时间是由扩增片段的大小决定的，1kb以内的DNA片段，延伸时间在1min左右；3～4kb的扩增片段，延伸时间在3～4min；10kb则需要延伸10min以上。

循环次数决定了整个PCR的扩增程度，一般设计在30～40次之间为好。设计次数过少，目的片段产物过低，不容易检测；扩增次数过多，产生的非特异性产物也增多，对目的片段的检测产生干扰。

PCR反应各组分浓度的优化

PCR中Mg、引物及dNTP三种组分的浓度对扩增反应的影响较大。在对PCR反应进行优化的情况下，可根据数据库上的相关文献，参考已经发表的其他反应体系组分，对Mg、引物及dNTP的组分设置一系列的浓度，必要时可根据设置浓度的多少，进行正交试验设计“，利用同一个DNA样品进行相同程序下的扩增，根据目的片段的量的多少，确定哪种组分组合是最优的PCR反应组合。

PCR产物的检测

对PCR产物的检测效果可以对整个PCR反应体系进行优化，如在PCR扩增产物中检测出涂抹带或地毯样带，其主要原因为加入的酶的质量过多、dNTP浓度过高、Mg浓度过高、退火温度过低、循环次数过多等。根据这个原因，对PCR反应的各个组分的浓度进行调整，可以提高PCR的反应效。