1、PCR反应过程

（1）预变性(initial denaturation)

模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为2分钟。

（2）循环中的变性步骤

循环中一般95℃、30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

（3）引物退火(primer annealing)

退火温度需要从多方面决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。.然后，在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

（4）引物延伸

引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略。延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kb。

（5）循环数

大多数PCR含25~40个循环，过多易产生非特异扩增。

（6）最后延伸

在最后一个循环后，反应在72℃维持5~15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

2、PCR反应条件

PCR反应条件包括温度、时间和循环次数。

温度与时间的设置：基PCR原理三步骤而设置变性一退火一延伸3个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90~95℃变性，再迅速冷却至40~60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70~75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100~300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性、65℃左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。

（1）变性温度与时间

变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93~94℃ 1分钟足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

(2)退火（复性）温度与时间

退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40~60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值（解链温度）=4（G+C）+2（A+T）

复性温度=Tm值-（5~10℃）

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60s，足以使引物与模板之间完全结合。

（3）延伸温度与时间

Taq DNA聚合酶的生物学活性是：70~80℃时，每个酶分子每秒能合成150个核苷酸；70℃时，每个酶分子每秒能合成60个核苷酸；55℃时，每个酶分子每秒能合成24个核苷酸；高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1分钟即足够。3~4kb的靶序列需3~4分钟；扩增10kb需延伸至15分钟。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

3、PCR反应条件的控制

（1）PCR反应的缓冲液。提供合适的酸碱度与某些离子。

（2）镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。

（3）底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，一般为20~200μmol/L。

（4）TaqDNA聚合酶2.5U(100uL)。

（5）引物浓度一般为0.1~0.5umol/L。

（6）反应温度和循环次数。变性温度和时间为95℃、30秒；退火温度和时间低于引物Tm值5℃左右，一般在45~55℃；延伸温度和时间为72℃、1min/kb（10kb内）；Tm值=4（G+C）+2（A+T）。循环次数一般为25~30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

目前有许多检测和分析PCR扩增产物的方法应根据具体的实验条件、研究目的、研究对象采用不同的检测分析方法。只有通过对PCR产物进行严格的分析和鉴定，才能得出是否为准确可靠的特定扩增产物，还是非特异扩增。

1、凝胶检测

在检测PCR产物方法中，凝胶电泳是最常见、最简便的方法，通过该方法我们可以确定扩增产物的分子量大小和产物的特异性。其原理是因为DNA分子在通电的电泳缓冲液（偏碱性）中向正极泳动，其分子量越小，泳动速度越快，其电泳迁移率与线性DNA分子大小成负相关。凝胶电泳分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2、检测系统

（1）系统

用凝胶扫描仪或计算机辅助视频设备对溴化乙锭染色的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行定量，放射性标记的扩增产物可通过放射自显影定量测定，最近用自动DNA测序仪检测荧光标记的核酸，这种方法可准确测量扩增产物的大小，而且其检测灵敏度达飞克水平，但由于自动DNA测序仪和荧光标记引物极为品贵，所以现在仅用于研究。

（2）HPLC检测系统

该方法的优点为PCR产物不用纯化，对未标记的产物灵敏度可达飞克水平，对标记产物的检测限度可能更低。HPLC能区分不同分子的大小，可允许我们使用不同大小的内标衡量扩增的效率。

（3）固相测定系统

最常用的为96孔聚苯乙烯微量滴定板，可用仪器比色或读数。亲和素分子通过疏水相互作用包被滴定板。该固相系统可特异结合生物素或生物素化的分子，可用于生物素化的PCR产物的定量，如用生物素和地高辛双重标记的扩增产物，可用微量滴定板法定量。将生物素和地高辛同时标记PCR产物的方法有三种途径：①在反应混合物中同时加人地高辛(DIG)和生物素标记的脱氧核苷酸类似物（DIG-/Bio-dUTP）；②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP；③加入生物素引物1和地高辛标记的引物2。定量方法为：双重标记的扩增产物用乙醇沉淀以去除未结合的标记物，然后加至亲和素包被的微量滴定板上温育至少2小时，洗涤数次后，与DIG抗体-AP（碱性磷酸酶）结合物温育，根据其底物不同可产生不同的颜色。亲和素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术是一个有效、灵活和容易操作的技术，将成为定量PCR的一个关键技术。

（4）SPA（scintillation proximity assay）系统

用亲和素包被的氟微球作为固相载体，用生物素标记引物，在扩增时掺入氟化的核苷酸，扩增完成后，加入已包被的氟微球以捕获生物素化的PCR产物。该捕获过程可使PCR产物与氟微球紧密结合，氟被氘激发产生光脉冲，可用闪烁计数仪测量。与比色法相比，该方法具有更大的线性范围。

（5）点杂交检测系统

将扩增产物变性后固定于尼龙膜表面，与标记的DNA探针杂交，亦可将序列特异的寡核苷酸探针通过多聚T（poly T）尾巴固定于膜上，与变性后已标记的扩增产物杂交，在后者由于靶基因不是直接结合于膜表面，故其反应动力学接近于液相，反应速度快，通常使用生物素化的探针或扩增产物，用亲和素-AP结合物产生颜色斑点，通过与已知浓度的标准比较颜色强度进行定量。

（6）电化学发光检测系统

通过亲和素-生物素系统将扩增产物结合于磁性珠，然后与2,2'-联吡啶-钉螯合物（TBR）标记的探针杂交，加人三丙胺(tripropylamine, TPA)溶液，并转移至电化学发光仪的检测池。当电极的电压增加至一定水平时TPA和TBR都瞬时氧化，TPA氧化后生成一种不稳定的、具有高度还原性的中间物质，可与氧化的TBR反应，使之进入激发态，当由激发态变为基态时可发射出620nm的光，发光强度与TBR标记物的量成正比，通过发光强度对PCR产物定量，该法的敏感性为amol（1amol=10-18mol）水平，可自动化测量。

（7）DNA酶免疫测定系统

通过抗DNA单克隆抗体与扩增产物结合，再通过酶第二抗体结合物进行定量测定。该方法无需对引物和扩增产物进行标记，但易出现交叉反应和单克隆抗体昂贵的费用限制了该方法的广泛应用。

（8）激光诱导荧光检测法

首先用荧光标记物FAM（商品名）的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物借助氨已基连接臂偶联于正向引物的5'-核苷酸上，然后PCR扩增，用毛细管电泳扩增产物，最后用氩离子激光光原检测器检测荧光强度进行定量测定。该方法的优点为样本用量少，可自动化检测，快速、灵敏和高分辨率。

总之，可用上述方法对靶基因定量，其准确性可通过复管测定和利用内标使数据标准化而得到提高。亲和素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术具有有效、灵活和容易操作等特点，有较好的临床应用前景。定量PCR在肿瘤、细菌、真菌和病毒性疾病的诊断和治疗方面越来越发挥重要作用。

1、PCR产物的电泳检测时间

PCR产物的电泳检测时间一般为48小时以内，有些最好于当日电泳检测，大于48小时后带型不规则甚至消失（假阴性，不出现扩增条带）。

PCR反应的关键环节有：①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量及溴乙锭的使用；④PCR循环条件。寻找原因应针对上述环节进行分析研究。

2、模板

①模板中含有杂蛋白质；②模板中含有Taq酶抑制剂；③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④在提取制备模板时丢失过多或吸入酚；⑤模板核酸变性不彻底。若酶和引物不存在质量问题，未出现扩增带的原因极可能与标本的消化处理、模板核酸提取过程有关，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定而不宜随意更改。

3、酶失活

酶失活时，需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意排除不加Taq酶或溴乙锭所致。

4、引物

引物质量、引物浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，导致两条引物中一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。对策为：①选定一个好的引物合成单位；②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致。如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应与引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效；④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

5、Mg2+浓度

Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量，甚至使PCR扩增失败而不出现扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20uL、30uL、50uL或100uL。应用多大体积进行PCR扩增，应根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20uL后再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。

6、物理原因

缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

7、靶序列变异

如靶序列发生突变或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸人加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性，可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

8、假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性，需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染，这种污染有两种原因：①整个基因组或变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低、变性时间短，极有可能出现假阴性；②退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高则影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR成败的关键之一。

9、出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因有：①引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体；②Mg2+离子浓度过高、退火温度过低、PCR循环次数过多；③酶的质和量。往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物；②减小酶量或调换另一来源的酶；③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；④适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

10、出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差、dNTP浓度过高、Mg2+浓度过高、退火温度过低、循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶；②降低dNTP的浓度；③适当降低Mg2+浓度；④增加模板量，减少循环次数。

11、PCR中的污染

PCR中的污染主要来自：①样品间交叉污染；②先前PCR产物遗留(carry-over)。