由磁微粒交联问题引发的思考

目前对于发光平台，磁微粒已经成为了主流载体，但是主流的东西并不一定就是完美的，就像中国的相声。从事磁微粒研发平台的工程师们可能经常会遇到磁微粒交联的问题，这个是十分令人头疼的。有人问交联有什么问题呢？这么说吧，磁珠的交联就像是胶体金的死金一样，磁珠本身成名的因素之一就是它比较可观的比表面积，但是一旦交联了，这个优势荡然无存。我们接下来分析一下磁珠反应过程中出现的交联问题。

首先我先扯点别的，大家来看一下磁微粒平台目前的反应模式。我以安图生物的肿瘤标志物检测为例，跟大家说一下，见下图：

这些都是基于双抗夹心的肿瘤标志物检测项目，我们看到了他们大多数采用的是一步法检测，也有个别的采用两步法。一步法和两步法有什么区别呢？一步法一般是“（磁珠+酶+样本）x分钟+清洗+底物”的一步反应模式；两步法一般是“（磁珠+样本）x分钟+清洗+酶y分钟+清洗+底物”的反应模式。在这里跟大家着重提一下一步法加样顺序的问题。一步法中，先让样本和磁珠一起反应，还是先让样本和酶一起反应，亦或是想把磁珠和酶混在一起再加入样本一同反应，这3种情况得到的结果可能会差异很大，具体有多大，需要研发工程师自己去实践与体会，反正我自己是经历过，确实很大就是了。

我们来分析一下为什么有的项目舍弃快速的一步法而采用时间更长的两步法。第一，有可能是hook。类似于HCG这种的，如果高值血清浓度过高，超过了你试剂的承载范围，稀释样本又有所限制的，一步法估计就排除在外了；第二，受特异性的限制。如果一步法做出来的阴性背景总是很高，两步法又能解决的，那肯定是用两步法了。好了，不多说了，开始谈交联的问题。

之前在讲胶体金的时候就说到了，交联的问题主要是由于你所检测的标志物针对于你所用到的抗体是多价的。对于双抗夹心检测抗原标志物的项目来说，其实这种情况应该略微少一些，因为标志物的序列都很清晰，它到底有没有相同位点你大致可以分析出来。在做抗体筛选的时候，如果标酶和包被用相同的抗体反应强度还很高，估计这就是了，可以提前避免掉。但是检测抗体的项目就不一样了，抗体本身就是Y型对称结构，有一个位点必然对应另一个位点，就跟照镜子一样。比如你有一个鼠抗人IgG，包被和标酶都用它，测试人的IgG样本，发现反应强度依旧可以达到很高，反应模式如图中所示：

这时候有人就会问了，你不是说这种的会交联很严重嘛，为什么还有这么高的反应强度呢？其实这里的高反应强度是相对的，磁珠的交联势必会影响它本身的检测性能，比如如果不存在交联，我可以把人IgG的检测上限做到40g/L，但是一旦存在交联，可能也就能做到20g/L了。

也会有人问，磁珠的交联意味着两个相同的位点同时被封闭，怎么还会有多余的位点和酶标抗体去反应呢？这就要说一下磁珠和抗体的关系了。我们一般用的磁微粒一般为1um的，而抗体的直径大致也就10nm附近，相差了近100倍，剩余的反应位点是球与球之间的缝隙空出来的（见下图），虽然能保证一定程度的反应强度，但交联的微球终究会降低比表面积的优势，导致检测范围的下降。

其实，我们回来考虑一下，微球的交联跟我们之前讲的胶体金的交联相比较来讲，其实还不算严重。为什么呢，因为磁珠跟抗体的粒径比例接近100倍，而胶体金跟抗体的粒径也就是4倍，一个1米的大球靠着身上1厘米的接触点去交联，肯定还不是那么容易，所以如果控制的合理，可能略微的交联并不会影响我们的预期性能。

下面我们来分析一下怎么能降低交联的可能性。

第一，减少微粒之间的碰撞。磁珠与样本反应的时候，如果一直处于振荡反应状态，那必将有利于微球之间的碰撞从而增加交联的可能性；但是如果不振荡，只是静置反应，那反应时间短和比表面积大的优势又因为磁珠的沉降而大大降低；所以，如何平衡这两者之间的关系至关重要，需要研发工程师对仪器振荡周期的设置准确把握。

第二，减少微球之间的近距离接触。我们知道，每次清洗步骤，都需要将磁珠吸附下来，强大的磁力作用导致磁珠之间密切地接触，产生交联的可能性大大增加，所以在清洗完成后有时候发现，磁珠重新振散的过程是比较困难的，所以在不影响试剂性能的情况下，尽量减少微球的清洗次数，这时候也体现出了一步法在这方面的优势。

第三，从磁珠本身来改善。如果磁珠跟磁珠之间本身带有略微的斥性，而又不影响它能被磁力板吸附，这不就太好了嘛！我不太清楚类似于酪蛋白封闭胶体金引发强负电斥力的原理在这里管不管用（如果管用了灵敏度受影响吗？），也不太清楚磁珠制造厂家有没有实现制造这种磁珠的可能性，反正这也是改善磁珠交联的一种思路。

今日讲到这里，与大家共勉。

来源：IVDdiagnosis

声明：本平台注明来源的稿件均为转载，仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！