上一篇我们介绍了目前已经进入临床的HER3相关双特异抗体，其中Merus的MCLA-128无异是值得期待的一款双特异抗体，本篇文章我们介绍一下这款优秀的抗体是如何筛选出来的。无论MCLA-128是否在后续的临床中获得成功，但是该抗体的筛选方法是值得我们借鉴的。
无偏见筛选获得最有潜力的双特异抗体
为了能够筛选到多种类型的抗体，研究者采用不同的方式免疫C57/BL小鼠，如表达HER2或者HER3的细胞，蛋白，DNA等同时也采用了混合模式的免疫增强策略。免疫后获取可变区VH基因并且与特定的人轻链cCL构建标准噬菌体库进行抗体筛选，最终获得63种HER2单克隆抗体，117种HER3单克隆抗体。其中HER2的抗体根据其结合的表位分为7大类，而HER3的抗体根据其结合的表位，以及对HRG激活的MCF-7的抑制能力分为7类。
首次筛选选取22 HER2 和32 HER3抗体两两配对组装成双特异抗体（抗体的构建利用Merus的Biclonics®双特异抗体平台：DEKK突变防止重链错配：一条重链上为D351，E368突变，另外一条重链上K351，K366突变；共同轻链防止轻链错配）。并利用表达HER2和HER3的BxPC-3细胞测试双抗的抑制作用。
第一轮的筛选表明含有结合HER2第一结构域的双抗具有较好的抑制肿瘤细胞生长的能力，因此研究者囊括了更多类型的HER2第一结构域的抗体，并与HER3的抗体组装成双抗进行第二轮筛选（共545种双抗）。筛选同样考察抗体对BxPC-3细胞的抑制能力（含有HRG和不含有HRG两种条件），结果有192种双抗在没有HRG的条件下可以抑制BxPC-3细胞的生长，236种双抗在HRG存在的条件下抑制BxPC-3细胞生长；并且82种抗体对BxPC-3的抑制能力强于曲妥单抗（已上市HER２单克隆抗体）。进一步验证后选取40个双抗进行进一步筛选（下图）
进一步的筛选检测抗体对MCF-7细胞的抑制能力，并且与已知的HER2或者HER3抗体进行比较（T：trastuzumab抗体，P：pertuzumab抗体；MM-121：一个HER3单抗；MM-111：HER2/HER3双抗）。40个双抗中选取9个抑制能力强于T+P的双抗在BxPC-3接种的动物模型中验证对肿瘤的抑制能力，最终选取4个（PB3710, PB3448, PB3441,和PB3566）对肿瘤细胞具有强劲抑制能力的双抗。
经过验证后选取药效最强的PB3566进行人源化改造，同时进行可开发性以及可制造性优化后获得最终的HER2/HER3双抗PB4188（临床中的MCLA-128）
功能验证及作用机制
PB4188可以在高浓度的HRG条件下抑制肿瘤
前期是在无差别的条件下筛选到了药效最强的双特异抗体，后续为功能上的进一步验证。与MM-121 HER3单抗相比，PB4188在高浓的HRG条件下依然具有很强的抑制能力，而其它HER2或者HER3抗体在较高的HRG浓度下机会丧失抑制能力（下图C和D）。
PB4188抑制HRG介导的HER2/HER3异源二聚体
HER家族可以通过异源二聚体激活下游信号，而HER2抗体可以抑制EGF诱导的EGFR/HER2二聚体，或者HRG诱导的HER2/HER4 和HER2/HER3二聚体的形成。而PB4188可以抑制HRG诱导的HER2/HER3二聚体以及EGFR/HER3二聚体的形成（下图A-D）
在毒性方面，有研究报道trastuzumab 单独或者与 pertuzumab联合使用，再和蒽环霉素一起使用会造成心肌细胞相关毒副作用，而PB4188不存在相关毒性（下图E）。
在抑制HER2/HER3相关下游信号通路磷酸化方面，PB4188可以有效的抑制HER3和Akt的磷酸化，从而防止相关通路的激活，进而抑制肿瘤细胞的生长（下图F-G）。
与HER2结合的Fab决定抗体的亲合力
在不同的肿瘤细胞中，PB4188与单价的HER2抗体（HER2 X TT: PB4188的Fab臂与不相干的抗体组成的双抗）具有相同的结合能力，这表明不同HER3的表达对抗体亲合力影响较小（下图A）。并且在HER２表达升高的肿瘤细胞中，HER2 X TT的亲和力和PB4188相当，而HER3 X TT的亲和力比PB4188高近10倍，这同样说明PB4188的亲和力由HER2 Fab决定（下表）。该现象同样在小鼠肿瘤模型中得到验证（下图B和C），因为HER3的高亲和力并没有使HER3单克隆抗体更多的集中于肿瘤部位。
PB4188 LF在体内抑制HRG诱导的肿瘤细胞的生长
PB4188 LF为低岩藻糖的PB4188，具有更强的ADCC效应。在对trastuzumab 和T-DM1耐药的JIMT-1肿瘤模型中，PB4188 LF展现了比T+P联合用药更强的肿瘤抑制能力，并且这种抑制具有剂量依赖性（下图A-C）。与对照组相比，PB4188 LF治疗组的小鼠肿瘤细胞上HER2/HER2二聚体含量更低（下图D），并且Akt的磷酸化水平更低（下图E）。
在PDX模型中，在用药介绍时（Day20）, PB4188 LF治疗组的小鼠存活率为100%，而T-DM1治疗组的存活率仅为40%（下图F）。OV-10-0050 PD模型中，来自于病人高表达HRG的肿瘤，在接受PB4188 LF治疗后，肿瘤完全消退（下图G）
PB4188对肿瘤细胞的抑制依赖于对HER2 第一结构域的结合
为了验证PB4188对肿瘤细胞的抑制是否依赖于对HER2第一结构域的结合，研究者选择了八个亲和力相当的，针对HER2不同结构域的抗体（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ每个结构域两个抗体）与PB4188中的抗HER3的抗体组合成双抗。体外肿瘤细胞抑制实验表明，只有结合第1结构域的双抗对肿瘤有较好的抑制效果，并且抑制率与HER2的表达，以及HRG的表达相关，(N87为HER2高表达肿瘤细胞，图B中具有更高的HRG含量)。
独特的结合方式造就了PB4188强的抑制能力
HER2细胞外结构域与PB4188的复合物结构表明，PB4188结合在HER2第1结构域的C端，两者的相互作用面为683 Å2，并且抗体Fab主要是通过重链的CDR区与HER2的HER2,的143–147 和160–181位的氨基酸相互作用。
HER3与PB4188 Fab的复合物结构表明，PB4188的Fab结合在HER3的第3结构域，并且抗体结合的是未激活性的HER3。HER3 第3结构域中突出的loop区的Y424, N425, R426氨基酸正好结合在抗体CDR形成的凹槽内（下图C和D）。与结合HER2的Fab不同，结合HER3的Fab的重链和轻链CDR区都参与的抗体与抗原的结合。另外抗体结合在HER3的第3结构域阻碍了配体HRG与HER3的结合，从而防止HER3的激活。
小角度X射线衍射结果证明PB4188可以同时和HER2，HER3两个抗原结合，并且抗体在两个抗原上的结合位点的距离大约为140 Å（E-G）
总结
MCLA-128双特异抗体的筛选与传统抗体通过亲和力，表位等筛选不同，其主要是通过无差别筛选，在前期忽略表位和亲和力对抗体的影响，主要考察抗体在高HRG浓度下对肿瘤细胞的抑制能力。其筛选流程如下图所示，这里不再赘述。
MCLA-128的Fab与HER3的复合物结构表明抗体结合于HER3的第Ⅲ结构域，并且阻碍了配体HRG与HER3的结合。抗体与HER2的复合物结构显示抗体结合在HER2远离细胞膜的第Ⅰ结构域，这在一定程度上使得抗体在结合HER2的同时能够自由的结合HER3。亲和力实验表明，抗体对肿瘤细胞的结合主要依赖于抗体对HER2的结合，抗体结合肿瘤细胞表明的HER2后，会导致肿瘤细胞上结合HER3的Fab增多，而且抗体Fab对HER３的高亲和力，两种因素共同作用使得抗体基本上完全阻断HER3，这就是所谓的‘‘dock & block’’作用机制。
文章中前半部分双特异抗体筛选为灵魂所在，后续只是对抗体功能的验证及作用机制的解读。MCLA-128的筛选让我们明白，双特异抗体并不是简单的两个不同靶点的单克隆抗体的组合，其中涉及很多方面的内容！
来源：抗体密码
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