很多研发的同志较多时候都会遇到样本难以收集的问题，尤其是高值的血清样本，更是凤毛麟角的存在。对于蛋白检测项目，这个简单，完全可以通过重组的方式制备高纯品掺入到人血液基质里滥竽充数，相信很多人吃了不少血清供应商的亏；对于抗体检测项目，比如传染病的、过敏或者自身免疫的，如果是定性试剂还好说，但是如果涉及到定量，当开展线性范围探究的时候，你发现想收集到线性范围高值区的血太难了，很多时候血清供应商想造假都没法造，为什么呢？他们就是想赚个快钱，谁会因为卖个血清还给你设置一个抗体开发平台呢？所以在没有人愿意为你涉险开辟新道路的时候，只能自己想办法。之前我做过一段时间的原料开发，我就结合自己的知识储备，聊一聊人源抗体制备的那些事。首先聊一聊最简单的制备方法—富集。由于现在的纯化工艺日益的先进，所以抗体的富集变的非常的简单便捷。我们可以将被检测抗体对应的抗原包被于磁珠，然后去第三方检验收集大量的血液制品，将包被好抗原的磁珠放置于血清中，富集我们想要的抗体。这样做的好处就是方便快捷，能够收集到不同来源、不同构型的各式各样的抗体，而且抗体的浓度可以自己控制，缺点就是血液收集的比较随机，血液里面的目标抗体的含量可能很低，不过，这终归是一个快速制备高值内参的一个比较省钱的途径。
然后咱们介绍几个比较烧钱但是一劳永逸的方法，一个是嵌合抗体的制备，另一个就是噬菌体展示技术。说实话，这两种技术都超出了我的认知，毕竟学历不在这，所以我只讲一讲自己了解的浅显的东西。今天先讲人-鼠嵌合抗体的制备。
学过免疫学的人基本上都知道，抗体有重链（H）和轻链（L）。不管哪个链，都有恒定区（C）和可变区（V）。在抗体识别特异性抗原的时候，起主要作用的是可变区，也就是图片中的VL和VH。出于伦理道德的考虑，我们不可能去用抗原免疫人制备人源抗体，我们能用的最简单的模型动物只能是小白鼠。但是生产出来的鼠单抗是没有人源抗体的Fc端的，也就是不能被抗人抗体识别，所以人们就想出了嵌合抗体这个东西。把小鼠单抗的VL和VH嫁接到人的CL和CH区域，让它既能识别抗原，又能被抗人抗体识别。我大致讲一下嵌合抗体的制备流程：
1.抗原的重组表达。查询文献，获取抗原的基因序列，设计引物，进行普通的PCR，连接T载体后，转入DH5a菌株进行培养，提取质粒进行测序，确认是我们想要的序列，然后将T质粒提取出来，双酶切，连接合适的载体，比如pet-28a，转入BL21菌株，IPTG诱导，进行表达验证（通常采用WesternBlot）。如果表达出的蛋白能和商业的抗体结合，那么我们就能确认这个蛋白我们得到了。后面的蛋白的亲和层析纯化过程，我就不讲了，感兴趣的同学可以自己去查文献，很简单。
2.制备单克隆杂交瘤细胞。用纯化的抗原免疫老鼠，免疫3次，抽取血清测试免疫效果，细胞融合前3天，进行最后1次的加强免疫，同时开始进行SP2/0瘤细胞的培养；细胞融合的前1天，需要制备并培养饲养细胞，然后进行细胞融合，铺进饲养细胞孔养5天，用HAT培养液筛选，10天左右在用HT培养液，2周左右再用含牛血清的培养液培养，期间可以吸取部分孔中的上清进行效价测试选取阳性强的孔进行杂交瘤细胞的克隆，采用有限稀释法选出单克隆杂交瘤，进行冻存。后续的腹腔注射杂交瘤制备抗体的方法，我也不再赘述了，通过正辛酸或者亲和层析可以得到大量的抗体。
3.Ig亚类的鉴定。我们知道，哺乳动物抗体的轻链有Kappa（κ）与 lambda（λ）2个亚型，重链有μ、γ、α、δ、ε链5种，分别对应的IgM，IgG，IgA，IgD和IgE5个类型。对于小鼠而言，通常产生的是IgG抗体，IgG抗体又分为IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgG4几种，κ和λ的比例为20：1。亚型的鉴定主要是给引物的设计提供方便。
4.嵌合抗体的制备。首先我们将人源抗体的重链和轻链的恒定区扩增出来，如下图：
引物设计的时候，要带上酶切位点，然后将扩增产物连接T载体，也就是要制备pGEM-T/CH和pGEM-T/CL；
然后裂解杂交瘤细胞，提取总的mRNA，然后根据小鼠抗体的亚型设计对应的引物，分别进行5-RACE反转录扩增、巢式扩增，举个例子：
按照上图中的步骤，我们可以获得pGEM-T/VH和pGEM-T/VL；根据测序结果，我们可以设计引物，将正确的VH和VL扩增出来，分别带上合适的酶切位点，如下图：
然后我们将小鼠扩增的VH和VL分别和人抗的CH和CL通过酶切位点连接起来，再通过T4连接pcDNA3.1（+）载体，转染到CHO-K1细胞中进行表达。
上次讲到了关于鼠-人嵌合抗体的制备，其实那只是最简单的也是最初一代的嵌合抗体制备的方法，对于IVD制备内参是足够了，对于制备抗体药还需要对可变区的CDR高变区及间隔CDR的框架进行位点改造才可以，如下图：
不过这已经超出了我们IVD的使用范围，造价会更高，着实没有必要。
今天来讲一下噬菌体展示技术。我只是看别人做过，自己没有动手过，所以了解的很肤浅，跟朋友们讲一下大概流程吧。
噬菌体展示技术不同于嵌合抗体的制备，嵌合抗体是鼠抗与人抗的嫁接，而噬菌体展示是从人的淋巴细胞里直接提取总的RNA做后续的工作，也就是需要先找到相关的临床病人；另外，嵌合抗体制备的时候改造的是单抗，也就是测试出来的可变区的序列是单一固定的，而噬菌体展示可以将针对于抗原的很多抗体扩增出来，形成一个抗体库，说白了就是单抗和多抗的区别；还有，我们所讲的嵌合抗体VL和VH是分开表达的，且和恒定区最终要连接在一起，噬菌体展示则是将VL和VH通过柔性肽连接起来，先筛选高亲和力的抗体。说白了，一句话，噬菌体展示技术为嵌合抗体的制备提供了更大的库存和更接近真实抗体的结构。
比如我们想制备某个癌症的特异性抗体，可以如下进行：1.反转录得到cDNA。先找几个临床确诊还未经治疗的志愿者的血液，分离淋巴细胞，裂解，抽提总RNA，进行反转录反应，得到反转录扩增产物。2.设计引物并扩增。查文献，考虑到人抗体基因的多样性，比如κ和λ亚型等等，依据VL和VH的CDR区域框架两端的恒定区域，设计尽可能覆盖大多数人的情况，保证大多数抗体基因的可变区序列能被扩增出来，同时引物设计的时候还要考虑酶切位点，所以这一步是需要一些技术含量的，可以参考如下的文献：
根据引物扩增得到扩增产物（VL和VH要分开扩增）。
3.扩增产物加入连接肽和酶切位点。上面说了，我们需要将VL和VH通过柔性肽（G4S）3连接起来，另外需要考虑后续和质粒载体的连接，需要加上酶切位点，根据上述考虑设计引物，以2步骤的产物为模板进行扩增（VL和VH同样要分开扩增）。4.VL和VH的组装。将3步骤中VL和VH的扩增产物混在一起进行扩增，也就得到将VL和VH通过连接肽基因串在一起了。
5.连接pCANTAB-5E载体。将VL和VH的连接产物以及pCANTAB-5E载体进行双酶切，T4酶连接，转入E.coli TG1细胞，涂布SOBAG平板培养。6.抗体库的鉴定。分为重组率鉴定、多样性鉴定、库容量的计算几个步骤。我们在平板上多挑取几个单克隆，提取质粒，双酶切验证一下，计算一下重组成功率；再把重组正确的质粒进行单酶切，比如BstN1，通过酶切片段的多样性反应重组序列的多样性；库容量其实就是单克隆的最终获取个数，将TG1菌株涂布300-500个平板，最终估算单菌落的量。
7.噬菌体溶液菌库的制备、筛选和鉴定。培养初级抗体库菌液，然后让辅助噬菌体M13KO7去侵染，把连接产物重组到噬菌体；噬菌体的筛选需要用到Elisa，就是把抗原包被于酶标板，用上一部制备的噬菌体侵染菌液去和抗原结合，然后通过甘氨酸溶液洗脱，再加入E.coli TG1培养，如此反复地淘洗几次，即可筛选得到有识别能力的重组噬菌体；随后再划平板，挑取几个单菌落培养，提质粒，双酶切后测序，Blast一下看看是不是我们想要的东西。
8.筛选特异性高亲和力强的克隆。多挑一些6步骤的单克隆，比如50-100个，然后用M13KO7去侵染，收取上清验证抗体的效价，同时可以设置一些对照验证特异性，选取效价较高、特异性又好的单克隆。每个单克隆里面可能含有不同序列的抗体，但是里面肯定至少有一条是我们需要的，这时候，把其对应的单克隆的质粒去扩增测序就可以了，我们肯定就能筛到我们想要的可变区序列，然后通过之前讲的嵌合抗体的制备方法让其与VH和CH序列通过overlapPCR就能连到一起。有些朋友如果想只获得只有可变区的可溶性蛋白，那么可以将上述筛选出来的较好的被侵染过M13KO7的抗体库菌液去侵染Ecoli HB2151，它可以帮助我们获取可溶性的蛋白。
最后我再概述一下关于pCANTAB 5E噬菌体展示系统：
人们利用噬菌体展示技术制备scFv噬菌体抗体库，经噬菌体抗体库筛选得到的噬菌体抗体通常具有较高的稳定性。pCANTAB 5E噬菌体展示系统是scfv噬菌体表面展示最常用的系统，该系统由噬菌粒载体（pCANTAB 5E）、宿主菌（大肠杆菌TG1、HB2151等）、辅助噬菌体M13K07等部分组成。
噬菌粒载体：pCANTAB 5E是scFv噬菌体表面展示最常用的噬菌粒载体，大小为4522bp，具体图谱及酶切位点如下所示：
宿主菌：pCANTAB 5E系统中宿主菌有大肠杆菌TG1及大肠杆菌HB2151两种，噬菌粒侵染两种宿主菌会得到两种不同的产物，侵染大肠杆菌TG1最终可得到scfv-plll融合蛋白，侵染大肠杆菌HB2151最终可得到可溶性的scFv蛋白。原因是在噬菌粒载体的目的基因插入位点末端有一段E-Tag短肽，短肽后有琥珀终止密码子，TG1菌株对琥珀终止密码子具有抑制性，蛋白翻译可通过琥珀终止密码继续翻译下游的Plll基因，最终产生scfv-plll融合蛋白，HB2151为非抑制株大肠杆菌，蛋白的合成在ScFv基因后即停止，最终会得到可溶性的scFv蛋白。
辅助噬菌体：M13K07辅助噬菌体是pCANTAB 5E噬菌体展示系统的重要组成部分。噬菌体转入宿主细胞后想要顺利传代必须要有辅助噬菌体的参与。
来源：IVDdiagnosis
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