大家好，在上一篇文章当中，我们对免疫诊断试剂的验证方法、开发和验证前研究进行了初步的了解，今天我们将来了解一下临床前验证，这也是本系列的最后一篇。
验证过程的这一部分的目的是确认诊断试剂在每次研究运行中继续按照预定的规格执行（即确保检测方法保持「受控」状态）。
它包括确定试剂的重现性、稳定性和线性，同时也检查其他因素，如样本的提取和储存以及方案/试剂的微小变化会如何影响检测。
这实际上是一种极限测试，在诊断试剂不再满足预定的使用要求（如精确度和准确度）之前，可以将其推到什么程度。
除了试剂的稳定性和提取效率外，验证前研究还包括对校准样本的重复测量，以确定在可接受的预定误差水平内是否能重现检测结果。
试剂验证是一个反复和不断发展的过程，因此，在验证前研究部分讨论的性能特征也应包括在临床前验证中。
为了清楚起见，这里只讨论额外的参数，如样本稳定性、试剂稳定性、线性等等。与上述验证前研究类似，验证标准的设定和验证所需的样本量都将取决于待验证试剂的预期用途、监管机构的要求和该使用领域的监管准则。
1、样本稳定性
样本稳定性是储存条件、被待测物的化学特性（和检测功能化学）、基质和容器系统的一个函数。样本稳定性实验中使用的条件应反映实际样本处理和分析中可能遇到的情况，如：
冻融稳定性（待测物的稳定性应在三次冻融循环后确定。低浓度和高浓度各至少有三个等分样本应储存在预定的仓库中）
短期稳定性（低浓度和高浓度各三个等分样本应在室温下解冻4~24小时并进行分析。）
长期稳定性
储备液稳定性（储备液和内部标准品的稳定性应在室温下评估至少6小时）
分离后稳定性（在处理时间内稳定）
-20℃和/或-80℃冻融稳定性实验需注意的要点：
准备18份高浓度样本（接近ULOQ）和18份低浓度样本（接近LLOQ）的等分样本（体积足以在检测中进行一式两份的分析），并为每个高浓度和低浓度样本标记3份FT1、3份FT2、3份FT3、3份FT4、3份FT5和3份FT6（FT指冷冻/融化）。
将所有等分样本冷冻足够长的时间，以确保它们完全冻结。然后在室温下解冻FT2~FT6，直到完全解冻。
重复FT3~FT6的过程，然后是FT4~FT6，等等，直到FT6被冻结六次。
在同一检测板上分析所有的等分样本，比较稳定性。
短期稳定性实验需注意的要点：
除在分析前0、2、4、8、12、24小时冷冻所有样本取出不同批次的样本外，重复上述FT稳定性的方法。这里的时间可以改变或缩短，以适应工作日的需要。
2、扩展线性范围
应进行这项分析，以证明高浓度样本（读数高于ULOQ的样本）可以被稀释并在测定仪上读取，其中乘以稀释系数可以得到实际的高样本浓度。
这类似于检测的平行性，即不使用加标样本，而使用高浓度的「真实」样本（即患病的病人或高度污染的食物）。
3、诊断试剂的稳定性
诊断试剂的稳定性是诊断试剂对程序和环境变化的敏感程度，它包括内因和外因两部分，内因是指试剂开发过程中，自身可能影响检测的因素，如试剂配方、孵育时间、样本类型、光照等等，这部分变化在试剂开发过程中已知并且被固化。
外因则是会发生变化的部分，如不同的操作者，不同的仪器，不同的试剂批次以及不同的运行批次之间的大小。
我们在产品设计和验证时，市场忽略了对运行批次大小的稳定性考虑，但这是一个很重要的因素，会对用户体验和成本带来很大的影响。
这些参数是非常密切相关的，所以，我们将内因和外因都要纳入试剂稳定性研究的考虑中，将其作为一个整体来对待。
每个检测项目所需的稳定性水平将取决于检测类型和地点，例如，POC检测必须非常稳定，因为它们面对各种各样不同的环境，复杂的环境对稳定性的要求更高；而大型自动检测设备则不必表现出那么多的稳定性，因为它们往往被放在恒温恒湿的实验室中，得到很好的保护。
对于稳定性试验，要评估的因素应该代表一旦检测「离开你的手」后可能发生的对方案的偏离，所以应分析诸如操作者或实验室的变化、孵化时间的变化、缓冲液的pH值和温度等参数。
4、验证报告
在最终验证报告中应提供对该免疫诊断试剂性能的完整说明。
在诊断试剂开发过程中，关键试剂配方的选择、试剂的方法学以及在方法开发阶段对所需要面对环境的理解都会发生变化。
这些因素将成为最终选择标准的一部分，需要某种形式的记录，通常在项目立项报告当中。随着诊断试剂在开发过程中的成熟和预期参数的确定，这也应该被记录下来。
并且随着最终产品的定型，这些参数应该被记录在标准操作程序（SOP）草案或分析程序中。
研究前的验证计划指导验证过程，并依赖于诊断试剂本身的验证SOP，该SOP可能仍是最终草案，也可能已被批准。
所有的验证实验都应保存其试验记录，随着验证的完成，实验的细节和有助于验证的数据必须编入验证报告。
重要的是要总结所有的运行情况，以准确说明试剂的性能。
研究前的验证数据应该在一定程度上预测样本分析过程中的可能取得的结果，所以我们可以用它来判断是否需要进入临床前验证。同时需要注意的是，由于稳定性数据经常随着时间的推移而获得，验证报告应随着新数据的产生而定期更新。
免疫诊断试剂是目前使用最多的试剂类型，它可以快速分析各种基质中的待测物。
在这个系列文章中，我们介绍了验证免疫测定法的一些关键因素。然而，根据该试剂的预期用途、使用环境、监管要求和批准标准，试剂开发人员可能需要使用本系列文章中所讨论的全部或部分参数来验证其试剂性能。
无论采用哪种验证参数，诊断试剂都应该适用于其预期的使用环境，并且能够发挥其应有的作用。希望本系列文章能够帮助相关的诊断试剂厂家提高产品开发的成功率，并能确保最佳的检测性能。
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来源： 诊断科学
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