Heat Labile – Salt Active Nuclease                       

HL-SAN热不稳定性耐高盐核酸酶                 

描述

无论是实验室规模样品制备、还是生产规模工艺过程，去除核酸都可以改善工艺流程，如蛋白纯化、病毒载体制备、mNGS中样品处理等过程。而核酸酶的选择，就显得特别重要。Heat Labile-Salt Active Nuclease (热不稳定性耐高盐核酸酶，HL-SAN) 是一种非特异性内切酶，在高盐浓度下具有最佳活性；且该酶在多种缓冲液中都有活性，很容易通过还原剂处理而失活。这些特性使HL-SAN在需要去除DNA和RNA的应用中，更为适合。

核酸污染，特别是宿主基因组DNA污染，在几乎所有工艺流程及生物制品的生产中，都是需要重点解决的问题。一方面，宿主DNA的存在，影响目标产物的纯化及下游质量分析等。另一方面，宿主DNA残留能引起机体严重的免疫反应，是生物制品的关键质量参数之一，FDA及NMPA等对Host Cell DNA (HCD)有严格的质控要求。

宿主基因组DNA中，组蛋白与DNA形成核小体，核小体紧密折叠形成结构复杂的染色质。组蛋白与DNA间存在强烈的离子作用及疏水作用，再加上特殊的结构，导致宿主DNA很难被准确检测并清除。已有文献表明，高盐浓度下组蛋白与DNA解离相对彻底，这有利于宿主DNA的检测及去除。但市售的绝大多数核酸酶在高盐浓度下活性很弱，甚至完全失活。而耐高盐的HL-SAN成了这类应用的理想选择。

推荐应用

1.     病原微生物诊断应用，如宏基因组测序（mNGS）样品去除宿主DNA；

2.     蛋白纯化，特别是DNA结合蛋白；

3.     病毒载体制备，如腺相关病毒（AAV）、腺病毒（AdV）等；

4.     其他需要去除宿主DNA的应用等。

优势

1.     高盐条件下，DNA清除效率更高，宿主DNA残留更少；

2.     pI为9.6，容易跟绝大多数蛋白分离；

3.     还原剂存在时，酶易失活，减少对后续流程的影响。

使用指导

1.     DNA去除方案

从细胞抽提物或细胞裂解液中去除DNA污染，HL-SAN的使用量受到多种因素影响，如细胞类型、裂解液组成、NaCl浓度、Mg²⁺浓度、裂解液pH等。参考方案见Figure 1。比如，对于1ml细胞裂解样品，调整到0.3-0.75 M NaCl浓度，加入1000 U HL-SAN，15℃-37℃温度条件下孵育30-60min，或者4℃过夜。Mg²⁺是必须的。

Figure 1. 不同样品、不同去除要求下，HL-SAN的推荐浓度及反应条件。（DNA removal的要求是指通过琼脂糖凝胶电泳看不到条带。Decontamination的去除要求是对23S rDNA进行qPCR检测为阴性。）

2.     灭活

灭活是通过添加还原剂（TCEP或DTT）来实现的，推荐用TCEP（因为TCEP在磷酸盐溶液中不稳定，特别在中性pH下）。不同工艺流程中，通过改变孵育时间、温度和还原剂的浓度等来灭活该酶。一般情况下， 25-37℃反应5-10分钟，可以灭活99%以上的酶。为了避免酶恢复活性、再次激活，保持低浓度还原剂，如0.1-0.5 mM DTT或TCEP，或延长灭活反应时间。

Figure 2. HL-SAN的灭活反应条件。

3.     去除

HL-SAN的pI是9.6，能够紧密结合阳离子交换柱。在pH 9.0条件下用0.2M盐冲洗，柱子的流出液/废液中只有不到0.02%酶脱落。需要注意的是，不推荐使用阴离子交换柱去除HL-SAN，因为HL-SAN的糖基化修饰会结合到柱子上。

Figure 3. HL-SAN紧密结合在SP-sepharose柱子上（体系是0.2 M盐浓度，pH 9.0）。

应用实例：

高效去除人体DNA (99.99%)干扰、快速检测下呼吸道感染（LRIs）病原

呼吸道感染（RIs）病原的快速检测一直是医疗中亟待解决的问题。RIs样本类型众多并且病原含量差别很大，同时带有大量的人体细胞，因此搭建一套快速、高效的样本处理系统对于通过高通量测序进行病原检测至关重要。

2019年Nature Biotechnology文章报道了如下流程。为了尽可能去除宿主DNA、提高检测灵敏度，在优化实验的人体宿主细胞去除、微生物DNA提取和nanopore测序等三个步骤都做了对应的优化，比如宿主DNA去除时找到了合适浓度的saponin（2.2%），HL-SAN步骤由两步减为一步，清洗步骤缩减为2次。最终，从拿到样本到建库完成缩短至6hr，且在最终检测中达到了96.6%的敏感性和100%的特异性。

Figure 4. Nanopore宏基因组快检流程。

酶学特征

来源：Pichia pastoris

酶比活：≥1.75 x 10^5 Units/mg

酶活定义：在37℃，25mM Tris-HCl，pH8.5 (25℃)，5mM MgCl2，500mM NaCl反应体系中，一个单位的HL-SAN在30分钟内消化50 µg/ml的小牛胸腺DNA（Sigma， D-1501），产生OD260nm处1A的吸光值变化。

特异性：非特异性内切核酸酶，能够将单链及双链的DNA及RNA，消化成5个碱基为主的寡核苷酸oligos。

酶活条件：（Effective是指活性在最优活性10%以上的条件范围）

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